WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 7 |

«РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ ...»

-- [ Страница 3 ] --

билатеральная симметрия и дорсо-вентральная организация зародышей не нарушаются в условиях невесомости. Такие зародыши демонстрируют некоторые морфологические отличия от нормальных на стадии дробления и бластулы, однако эти отличия полностью сглаживаются со стадии гаструлы (De Mazire et al., 1996). Симуляция микрогравитации в горизонтальном клиностате также не приводит к отклонениям в расположении и перемещениях компартментов ооцитов X. laevis (Neff et al., 1986), но приводит к ряду ранних морфологических отличий от контроля со стадии 8 бластомеров до вылупления – смещению борозды третьего деления, бластоцеля и дорсальной губы бластопора, а также увеличению головы и глаз (Neff et al.

, 1993; Souza et al., 1995). Интересно, что симулированная в центрифуге гипергравитация приводит к противоположным морфологическим изменениям, но в обоих случаях на стадии питающегося головастика опытные животные оказываются морфологически неотличимы от контрольных (Neff et al., 1993). Кроме того, центрифугирование непосредственно после оплодотворения с высокой частотой приводило к бифуркации осевых структур зародыша (Black, Gerhart, 1986; Neff et al., 1990). Более подробное исследование длительного влияния гипергравитации в «дозах» 2g, 5g, 7g и 10g на развитие X. leavis также выявило случаи бифуркации зародыша с формированием двух голов и замедление развития, а также высокую частоту микроцефалии, если воздействие имело место с оплодотворения и до вылупления. Внешние аномалии сопровождались менее развитыми и дифференцированными, чем в контроле, мышцами, хордой и нервной системой центрифугированных зародышей. Если же воздействие измененной гравитационной нагрузки применяли, начиная со стадии гаструлы, существенных морфологических нарушений у зародышей не наблюдалось (Kashiwagi et al., 2003). Микроцефалия, уменьшение глаз и замедление развития наблюдались и в следующем эксперименте тех же авторов. Морфологическим аномалиям сопутствовало увеличение уровня апоптоза в мозге и глазах и снижение уровня экспрессии генов Xotx2 и Xag1, вовлеченных в развитие мозга и глаз и разметку зародыша; однако эти эффекты были заметны при перегрузке в 5g, но не в 2g (Kawakami et al., 2006). Позднее (со стадии гаструлы до начала питания) воздействие перегрузок в 7g и 10g также приводило к замедлению развития, уменьшению размера тела. При этом, хотя и не увеличивало частоту морфологических аномалий, воздействие высокими «дозами» гравитационной нагрузки приводило к увеличению головного хряща и степени его асимметрии (Remus, Wiens, 2008). В данных экспериментах очевидна зависимость исхода воздействия от его длительности и стадии развития, на которой оно применялось.

Работа, исследовавшая влияние невесомости на формирование хвоста X. leavis на более поздних стадиях развития, начиная со стадии хвостовой почки или почки передней конечности, продемонстрировала проявление в этих условиях интересного морфологического эффекта – загиба формирующегося хвоста кверху (Horn, Gabriel, 2011).

9.2 Гравитационная биология развития Pleurodeles waltl Преимущества тритонов P. waltl в качестве модельного объекта при изучении влияния гравитационной нагрузки на различные аспекты развития и регенерации были продемонстрированы в экспериментах французских авторов и сотрудников лаборатории проблем регенерации ИБР РАН в 1980-х годах (Gualandris et al., 1996). Среди них – неприхотливость, легкость манипуляций с животными, способность легко переносить голодание до 4 недель; внутреннее оплодотворение и способность сперматозоидов длительное время сохранять жизнеспособность в клоаке самки; медленное эмбриональное развитие; неприхотливость культур эмбриональных клеток, возможность получать различные функциональные и морфологические дифференцировки на простой среде со сменой среды раз в 3 недели и временно обратимо останавливать развитие культуры охлаждением до 5°С; способность к регенерации многих тканей и частей тела.

Эксперименты по оплодотворению в условиях космического полета показали, что, как и в случае X. laevis, формирование билатеральной симметрии и дорсо-вентральной организации зародыша происходит нормально в условиях невесомости (Gualandris et al., 1996). Микрогравитация несколько изменяла распределение пигмента в оплодотворенном яйце в ходе кортикальной реакции, однако эти различия между опытом и контролем сглаживались после стадии 4-х бластомеров. Гравитационная нагрузка, приложенная к оплодотворенным яйцам хотя бы на два часа, оказывала существенное влияние на характеристики микроворсинок на разных стадиях после оплодотворения – диаметр микроворсинок, соотношение различных типов.

В явной зависимости от дозы гравитационной нагрузки (от невесомости до перегрузки в 3g) оказались такие характеристики микроворсинок, как плотность распределения (обратная зависимость) и длина (прямая зависимость) (Aimar et al., 2000). Было так же показано, что оплодотворение P. waltl в условиях космического полета не оказывает влияния на дальнейшее развитие в наземных условиях и фертильность полученных животных, а так же на характеристики их потомства (Dournon et al., 2001). Было показано, что морфогенез зародышей затрагивается действием микрогравитации на более поздних стадиях: так, в невесомости наблюдалась высокая частота неполного закрытия нервной трубки на стадии нейруляции; к стадии хвостовой почки нервная трубка закрывалась, однако наблюдался высокий процент зародышей с микроцефалией (Gualandris-Parisot et al., 2001). Эти нарушения, однако, компенсировались в развитии; в остальных системах органогенез до стадии хвостовой почти при действии невесомости проходил нормально и без изменения темпов достижения стадий эмбрионального развития (Husson et al., 1998; GualandrisParisot et al., 2001). Дифференцировка эмбриональных клеток, полученных из нейроэктодермы, так же проходила без нарушений, при этом формировались нервные, мышечные, хрящевые, пигментные клетки, фибробласты с нормальной морфологией.

Отдельные аспекты функциональной дифференцировки (например, синтез нейромедиатора ГАБК) так же были проверены и не отличались на Земле и в невесомости.

Так же было отмечено, что в условиях космического полета культуры созревали быстрее, чем при наземном содержании, но гравитационная нагрузка не была в данном случае действующим фактором: те же изменения были отмечены и в 1g-контроле на борту спутника (Husson et al., 1998). Что касается воздействия измененной гравитационной нагрузки на взрослых особей, оказалось, что в условиях космического полета меняется активируемый у иммунизированных животных набор и уровень экспрессии генов тяжелых цепей иммуноглобулинов, снижается уровень соматической гипермутации в них (Bascove et al., 2009; 2011). Воздействие космического полета, так же как перегрузок в 3g на центрифуге и симулированной невесомости в клиностате, в ходе эмбрионального развития так же оказывало значительный эффект на уровень экспрессии мРНК генов тяжелых цепей иммуноглобулинов, а также некоторых других генов, связанных с лимфопоэзом (Huin-Schohn et al., 2013). Интересно, что экспрессия этих генов увеличивалась в условиях космического полета, перегрузок и теплового шока, но уменьшалась в условиях симулированной невесомости.

9.3 Регенерация Pleurodeles waltl в условиях космического полета и измененной гравитационной нагрузки В лаборатории проблем регенерации ИБР РАН большое внимание уделялось изучению регенерации у тритонов P. waltl при действии измененной гравитационной нагрузки. Регенерация хрусталика в невесомости шла нормально, и последовательные стадии регенерации наступали в те же сроки, что у контрольных животных, однако получавшиеся регенераты были больше контрольных в 1,5–2,0 раза, что было обусловлено повышением уровня пролиферативной активности клеток как в самом регенерате, так и в дорсальной радужке – клеточном источнике регенерации хрусталика (Mitashov et al., 1987a). Данные по пролиферативной активности клеток подтвердились многочисленными последующими экспериментами, в то же время в части экспериментов было отмечено также и ускорение темпов регенерации хрусталика (Mitashov et al., 1996). Также было показано, что усиленная пролиферация клеток сочетается с повышением количества детектируемого иммунохимическими методами ростового фактора FGF2 в эпителиальном слое хрусталика и некоторых областях радужки (Grigoryan et al., 2006; Grigoryan et al., 2008). Регенерация сетчатки и дифференцировка ее слоев протекали быстрее в условиях космического полета (Grigoryan et al., 1999), а также в условиях симулированной невесомости на радиальном клиностате (Grigoryan, Anton, 1994; Anton et al., 1996;

Grigoryan et al., 1998). Кроме того, более высоким был и уровень пролиферативной активности клеток ростовой зоны сетчатки (Grigoryan et al., 2002). Было отмечено ускоренное достижение последовательных стадий эпиморфной регенерации конечности в условиях космического полета (Mitashov et al., 1987a) и повышение уровня пролиферации клеток бластемы конечности (Mitashov et al., 1987b; Mitashov et al., 1990; Grigoryan et al., 1992), сочетающееся с ускоренной деминерализацией скелетных элементов (Брушлинская и др., 1994). Обработка данных нескольких космических экспериментов, проводимых на разных сроках регенерации в различное время, показала, что ускорение регенерации конечности проявляется на стадии роста бластемы, вне зависимости от того, протекает эта стадия в невесомости, либо же достигается после приземления (Mitashov et al., 1996;

Брушлинская и др., 1997). В то же время было отмечено, что способность к регенерации иссеченных мышц в невесомости снизилась, т.е. тканевая регенерация, в отличие от эпиморфной, была ингибирована низкой дозой гравитационной нагрузки (Брушлинская и др., 1997).

В совместных экспериментах с французскими авторами было показано, что условия космического полета не нарушают морфогенез регенерирующего хвоста: спинной мозг, мышцы и хрящ регенерируют так же, как в контроле. Однако в том же эксперименте были отмечены искривления и локальные утолщения эпидермиса, сформированного в космическом полете, в то время как в контроле раневой эпидермис имел равномерную толщину. Так же имела место усиленная пигментация бластемы за счет существенно большего, чем в контроле, количества меланоцитов и меланосом (Grinfeld et al., 1994;

1996). Совместные эксперименты с немецкими коллегами показали, что и в условиях космического полета, и в симулированной с помощью клиностата невесомости имело место ускорение регенерации хвоста (Anton et al., 1996; Grigoryan et al., 2002). Хотя первые попытки оценить пролиферативную активность клеток в регенерате хвоста с использованием радиоактивной метки не дали результатов, в более поздних экспериментах с доставкой предшественника синтеза ДНК бромдеоксиуридина было показано, что и микрогравитация, и кратковременная перегрузка при посадке примерно в полтора раза повышает количество делящихся эпидермальных, бластемных клеток, меланофоров. Так же было отмечено, что меченые клетки располагались кластерами в условиях невесомости, в то время как в контрольных регенератах были распределены равномерно (Grigoryan et al., 2006). В том числе, высокой пролиферативной активностью по сравнению с контролем обладали и эпендимные клетки, особенно в зоне терминального пузырька, а также БрдУ-меченой оказывалась практически вся популяция хондробластов (Grigoryan et al., 2008).

Морфогенетический эффект гипергравитации был выявлен в эксперименте, проведенном в 2007 в ИБР РАН им. Кольцова совместно с Эймским Исследовательским Центром НАСА (NASA Ames Research Center). В эксперименте были три задействованы группы тритонов P. waltl: опытная, экспонированная на борту КА Фотон М3 в течение 20 дней в камере на подложке с малым количеством воды; группа синхронного лабораторного контроля в аналогичной камере; аквариальный лабораторный контроль, содержащийся в большом объеме воды. В синхронном контроле была очевидна дорсовентральная асимметрия регенерата, приведшая к изменению его формы от симметричной ланцетовидной к загнутой крючкообразной. Внешнему изменению формы соответствовало изменение направления роста спинного мозга, позвоночника и мышц.

Такая форма роста регенерата хвоста была свойственна только животным, находящимся в условиях гравитационной нагрузки (синхронный контроль). Для количественной оценки эффекта использовался морфометрический метод; был выбран угол, отражающий изменение формы регенерата. Морфологическое исследование показало, что отличительной чертой регенератов из синхронного контроля на IV–V стадии является разрастание эпителиальной ткани (7–8 слоев клеток) на кончике и дорсальной стороне регенерата.

Загнутый кончик регенерата в некоторых случаях содержал полость, а формирование мышечных волокон наблюдалось дистальнее, чем в регенератах полетных животных. Регенераты исследовали и на включение БрдУ метки. При сравнении регенератов синхронного контроля и полетной группы было обнаружено более высокое содержание БрдУ+ клеток в эпителии покровов на дорсальной стороне регенератов животных синхронного контроля. В связи с этим было высказано предположение, что дорсовентральная асимметрия в синхронном контроле была вызвана преобладающим ростом клеток на дорсальной стороне регенерата, а отсутствие этого явления и сбалансированный рост клеток в регенератах полетных животных приводил к формированию симметричного, ланцетовидного хвоста. На клеточном уровне, различия в дорсовентральном плане строения регенерата хвоста могут быть вызваны изменениями в балансе пролиферативной активности, миграции и гибели клеток бластемы в условиях низкой (полет и аквариальный контроль) и высокой (синхронный контроль) гравитационной нагрузки. В молекулярный механизм этого явления могут быть вовлечены как гены, ответственные за дорсовентральную асимметрию, в частности транскрипционные факторы и сигнальные молекулы, так и эпигенетические молекулярные факторы (Grigoryan et al., 2008).

9.4 Примеры молекулярных эффектов измененной гравитационной нагрузки Делались попытки найти объяснения изменениям, происходящим на клеточном уровне, с помощью изучения экспрессии различных молекул. Например, в условиях космического полета наблюдалась более интенсивное, чем в контроле, мечение антителами к ростовому фактору FGF2 в области дедифференцирующихся мышц, эпендимной трубки и формирующегося хряща (Grigoryan et al., 2006; 2008). Одним из многообещающих направлений исследований является роль белков теплового шока в изменениях, вызванных гравитационной нагрузкой. Пока что в пользу этого свидетельствуют разрозненные данные, полученные на разных моделях; в то же время, в совокупности они говорят о высокой вероятности регуляции регенерации со стороны системы белков теплового шока в условиях измененной гравитационной нагрузки, а также об универсальности и широком распространении такого ответа. Так, длительная невесомость в условиях космического полета или клиновращения, симулирующего физиологическую невесомость, (но не кратковременная невесомость в параболическом полете и не гипергравитация в центрифуге) приводит к индукции экспрессии генов Hsp17.6a и Hsp101 в растительной культуре Arabidopsis thaliana (Zupanska et al., 2013). В культуре лимфоцитов человека в условиях космического полета через 24 часа наблюдалась повышенная экспрессия Hsp27 и сопоставимая с контролем экспрессия конститутивной и индуцируемой форм Hsp70 (Cubano, Lewis, 2001). Исследование культур остеобластов мыши в полете показало практически полное ингибирование экспрессии гена Hsp70, снижение уровня экспрессии hsc73 на 40% и Hsp47 на 80% от контрольного уровня за пять дней полета. Этим изменениям сопутствовало пятикратное снижение концентрации TGF-1 в среде, что может свидетельствовать о наличии тенденции к усиленному апоптозу в невесомости (Kumei et al., 2003). Мышцы мышей, подвергавшихся 9-дневному космическому полету, характеризовались сниженной экспрессией генов Hsp27, Hsp70 и Hsp84 (Ishihara et al., 2008). На D. rerio было показано, что 15-дневный космический полет увеличивает уровень синтеза HSP72 в коже, мышцах и селезенке взрослых животных по сравнению с контролем (Ohnishi et al., 1996; 1998). С использованием технологии определения экспрессии генов у D. rerio in vivo с помощью репортерного гена GFP (Gillette-Ferguson et al., 2003) было показано, что в развивающемся хрусталике имеет место повышение уровня экспрессии гена Hsp70 в условиях симулированной невесомости и гипергравитации, а также коррелирующее с этим снижение уровня апоптоза в тех же условиях (Shimada, Moorman, 2006).

При использовании подобной технологии с промотором гена -Actin было показано, что разные ткани (сердце, хорда, сомиты, глаз, механорецепторные нейроны Рохона-Берда) обладают разным периодом чувствительности к действию невесомости и проявляют в этот период наиболее выраженное изменение экспрессии генов; однако при достаточно длительном воздействии эти изменения сглаживаются (Shimada et al., 2005). Интересно, что эти периоды в разных органах и тканях хорошо согласуются с периодами, когда в развитии изучаемых органов играют роль первичные реснички – широко распространенные клеточные органеллы, выполняющие сенсорные, транспортные, регуляторные функции. На примере механорецепторных нейронов удалось показать, что характерные изменения экспрессии генов в невесомости исчезают после уничтожения ресничек инкубацией в растворе хлоральгидрата и вновь проявляются после отмывки и восстановления ресничек (Moorman et al., 2007; Moorman, Shorr, 2008).

На X. leavis удалось обнаружить, что центрифугирование с перегрузкой 3g в течение трех дней до или после вылупления приводит к увеличению количеств белков HSP60 и HSP70. Действие симулированной невесомости в клиностате оказывало такой же эффект лишь на белок HSP60 и только при воздействии за 3 дня до вылупления (Rizzo et al., 2002). В уже цитированном эксперименте (Huin-Schohn et al., 2013) была проведена оценка экспрессии генов Hsp70, Hsp90 и hsf1 у 13-дневных личинок P. waltl после 10 дней космического полета, клиностатирования или центрифугирования. Во всех случаях уровень экспрессии Hsp70 был слишком низок для анализа, уровень экспрессии Hsp90 не затрагивался действием измененной нагрузки, а уровень экспрессии hsf1 значительно увеличивался в условиях космического полета, но не при перегрузках, и симулированной невесомости. Иммуногистохимический анализ локализации белков теплового шока HSP70 и HSP90 при регенерации тканей глаза P. waltl в условиях космического полета был проведен в лаборатории проблем регенерации ИБР РАН. В то время как белок HSP70 не был обнаружен на срезах глаза, белок HSP90 присутствовал в больших количествах в Мюллеровских клетках сетчатки, причем в полете уровень иммунофлуоресценции был заметно выше контрольного (Grigoryan et al., 2008).

Из результатов, представленных в последнем разделе «Обзора литературы»

очевидно, что изучение влияния фактора гравитационной нагрузки на морфогенез развивающихся и регенерирующих органов и тканей (в нашем случае хвоста) и тем более молекулярных механизмов, опосредующих эффекты гравитации, находится еще в самом начале. Возможно, в первую очередь это связано с ограниченной доступностью материала для изучения. В тоже время это направление гравитационной биологии очень актуально и имеет все шансы быстрого развития в связи с наличием технологий для исследований на молекулярном уровне.

Материалы и методы 1 Содержание животных и операции

1.1 Общие принципы Работу проводили на иглистых тритонах Pleurodeles waltl (Michahelles, 1830), разведенных и выращенных в аквариальном блоке ИБР РАН. В эксперименте использовали прошедших метаморфоз, половозрелых особей в возрасте 10–14 месяцев.

Животные в этом возрасте достигали длины 10–18 см при массе тела 15–20 г. Для каждого эксперимента подбирали особей максимально близких по возрасту, длине и массе тела, а общую выборку разбивали на экспериментальные группы таким образом, чтобы средние значения длины и массы тела в группах совпадали. В лаборатории животные находились в аквариумах размером 30 17 15 см3, заполненных отстойной водопроводной водой (6 л), по 5–10 особей, в условиях естественной смены дня и ночи при комнатной температуре (за исключением экспериментов по тепловому шоку). Животных кормили два раза в неделю мотылем – личинками Chironomus. Содержание и операции животных проводили в соответствии с правилами биоэтики РАН. За сутки до операции животным прекращали давать корм. Непосредственно перед операцией тритонов наркотизировали в течение 10 мин в растворе MS-222 (1:1000) (Maden, 1999).

Затем с помощью стального лезвия производили ампутацию дистальной трети хвоста. Уровень ампутации определяли индивидуально для каждого животного, измеряя длину интактного хвоста. После операции животных помещали в отсадники с малым количеством воды до прекращения действия наркоза (примерно на 1 час), по восстановлении мышечного тонуса и нормальной двигательной активности животных рассаживали по контейнерам.

Кровотечение после операции было незначительным и полностью прекращалось через 5– 10 мин после ампутации. Случаев гибели животного или отсутствия регенерации после операции не было.

1.2 Содержание животных на субстрате Для экспериментов по изучению морфогенетического действия измененной гравитационной нагрузки часть животных («субстратная группа») с первого дня после в контейнерах размером 11 25 39 см3 на гигроскопичной ампутации содержали подложке (Aqualine, Германия), пропитанной отстойной водопроводной водой (500 мл), по 5–10 животных в контейнере. Контрольную группу содержали в аквариумах, как описано выше. Температурный и световой режим для обеих групп был идентичен.

Животных из субстратной группы на время кормления (30 мин) перемещали в аквариумы с большим количеством воды.

1.3 Тепловой шок Тепловой шок использовали как самостоятельное экспериментальное воздействие, а также для получения материалов положительного контроля при изучении экспрессии генов и локализации белков теплового шока. В первом случае животных подвергали тепловому шоку перед ампутацией дистальной трети хвоста и далее еженедельно в течение всего хода регенерации. Во втором случае тепловому шоку однократно подвергали неоперированных животных, после чего наркотизировали, а ткани хвоста фиксировали для дальнейшего анализа.

Параметры теплового шока определялись по стандартному для амфибий протоколу (Hutchinson, 1961). Животных помещали в аквариум с водой комнатной температуры.

Далее воду постепенно нагревали со скоростью 1°C /мин (путем замещения части воды более теплой) до достижения критического температурного максимума (КТМ) – температуры, при которой в поведении животных появляются резкие изменения:

замирание, хаотичные движения, конвульсии. Это происходило при КТМ = 34°C, что сопоставимо с литературными данными по другим видам амфибий. Для экспериментов по тепловому шоку максимальное значение температуры рассчитывали как КТМ – 2°C = 32°C. При этом нагревание проводили следующим образом: 1) со скоростью 2°C/10 мин поднимали температуру воды от комнатной до 26°C (около 30 мин); 2) со скоростью 1°C/10 мин доводили температуру до 32°C (60 мин); 3) поддерживали температуру воды на уровне 32°C в течение 60 мин; 4) пассивно остужали воду до исходной температуры в течение 90–120 мин.

2 Морфометрическое изучение регенератов хвоста Для этого животных из разных групп одновременно оперировали и рассаживали в зависимости от заданных экспериментальных условий. Животных фотографировали с помощью бинокулярной камеры Китай) и Webbers MYscope 300M (Webbers, программного обеспечения ScopePhoto Image Software (ScopeTek, Китай), расположив хвост латеральной стороной на предметном столике. Фотографирование производили непосредственно после ампутации, и затем раз в неделю в течение эксперимента.

Для анализа индивидуальных характеристик каждого животного использовали особенности пигментации – темные пятна и точки на коже хвоста. Они же служили реперными точками для совмещения последовательных изображений, полученных на протяжении эксперимента для каждого животного. В графическом редакторе Adobe® Photoshop® CS5 эти изображения совмещали, устраняя артефакты – колебаний размера изображения, отклонений положения хвоста на изображении от строго горизонтального.

При этом использовали инструменты для поворота и изменения размера без изменения пропорций изображения. После совмещения изображений на них отмечали уровень ампутации и проводили вычисления длины и основания регенерата, а также угла между кончиком регенерата хвоста относительно горизонтали вентральной его стороны (угла загиба хвоста, УЗХ) (рис. 1). Для проведения измерений использовали Adobe® ExtendScript Toolkit 2. Статистическую обработку полученных данных проводили в редакторе 2007 и программе Microsoft Office Excel STATISTICA 8.0.

Рис. 1. Параметры, измеряемые при морфометрическом анализе регенератов.

Показателем изменения формы хвоста являлось отклонение УЗХ от контрольных значений. Однако, поскольку на этот показатель оказывают влияние вариации в значениях длины и основания регенерата, мы ввели использование нормированного коэффициента угла загиба хвоста K, рассчитываемого по формуле: K = Ltan/H, где L – длина регенерата, tan – тангенс УЗХ, H – основание регенерата. Таким образом, коэффициент K отражает положение проекции кончика хвоста на основание регенерата. В абсолютно симметричном регенерате значение K будет равняться 0,5, а уменьшение K означает наличие загиба хвоста в вентральном направлении.

3 Эксперименты по исследованию обратимости морфогенетического эффекта Для проверки обратимости эффекта проводили эксперимент со сменой условий содержания тритонов в ходе регенерации хвоста (рис. 2). Исходно формировали две группы: аквариальный контроль (5 животных) и субстратную группу (15 животных).

После операции животных рассаживали и содержали в соответствующих условиях (см.

подразделы 1.1 и 1.2). Формирующиеся регенераты фотографировали еженедельно для морфометрического анализа и обрабатывали фотографии, как описано в разделе 2.

Статистический анализ значений коэффициента K в двух группах также проводили еженедельно, наряду с визуальной оценкой хода регенерации. После того, как статистически значимое различие средних значений K в двух группах регистрировалось в двух последовательных измерениях, часть животных из субстратной группы переносили в контейнеры для содержания аквариального контроля. Отбор тритонов осуществляли таким образом, чтобы две подгруппы, образующиеся при разделении субстратной группы, статистически не отличались между собой по морфометрическим показателям. После переноса части животных из субстратной группы в условия аквариума регенераты хвоста во всех группах фотографировали дважды в неделю, а полученные фотографии обрабатывали морфометрически, как описано в разделе 2. После каждой съемки сравнивали морфометрические характеристики регенератов трех групп.

Рис. 2. Схема эксперимента для проверки обратимости эффекта загиба хвоста.

4 Морфологическое изучение регенератов хвоста Для морфологического изучения формировали две группы – субстратную и аквариальный контроль – по 9 животных в каждой группе, животных оперировали и рассаживали. Через 14, 28 и 49 дней после ампутации хвоста по 3 тритона из каждой группы повторно наркотизировали и отделяли регенерат с 1 мм культи. Материал фиксировали в растворе Буэна (пикриновая кислота: формалин: ледяная уксусная кислота = 15: 5: 1). После отмывки и дегидратации материал заливали в среду Histomix® (БиоВитрум, Россия), получали серийные сагиттальные срезы (5 мкм), окрашивали их гематоксилином Эрлиха и заключали под покровные стекла в среду Biomount™ (BioWORLD, США). Для определения стадий регенерации хвоста использовали принятую классификацию (Iten, Bryant, 1976a). На сагиттальных срезах регенератов хвоста анализировали дорсовентральные отличия, а также степень развития формирующихся спинного мозга и позвоночника. Морфологические исследования проводили с помощью микроскопа Carl Zeiss Axiovert 25 и окулярной камеры Webbers MYscope 300М, изображения регистрировали с помощью программного обеспечения ScopePhoto Image Software.

5 Изучение пролиферативной активности клеток в регенератах хвоста Для изучения пролиферации формировали две группы – субстратную и аквариальный контроль – по 9 животных в каждой группе, которых оперировали и затем рассаживали.

Материал (по 3 образца из аквариального контроля и группы на субстрате) фиксировали через 24 часа после ампутации, на I (7 дней п/оп) и II (14 дней п/оп) стадиях регенерации. Для фиксации брали регенерат и 1 мм культи. Ампутированную треть хвоста также фиксировали для использования в качестве интактного контроля. Изучение пролиферативной активности клеток хвоста проводили с использованием импульсной метки предшественником ДНК, аналогом тимидина 5-бромо-2'-дезоксиуридином (БрдУ).

Для этого за 3 часа до фиксации животным внутрибрюшинно вводили концентрированный водный раствор БрдУ (10:1) (Zymed® BrdU Labeling Reagent, Zymed Laboratories, США) из расчета 20 мкл/1 г веса (приблизительно 0,35 мл раствора при средней массе животного около 17,5 г). Материал фиксировали в 4% растворе формальдегида (Reagent grade crystalline paraformaldehyde, Sigma-Aldrich, США) на 0,01 M фосфатно-солевом буфере c pH 7,4 (PBS tablets, Amresco, США) при температуре +4°С, обрабатывали для заливки в парафин, получали серийные сагиттальные парафиновые срезы (5 мкм). Включение БрдУ в регенерирующие ткани определяли с помощью набора реактивов Zymed® BrdU Staining Kit (Zymed Laboratories, США), обеспечивающего определение локализации предшественника с помощью специфических антител с пероксидазной меткой. Окрашенные срезы анализировали под световым микроскопом Carl Zeiss Axiovert 25, подсчитывая количество меченых клеток в эпидермисе (отдельно в вентральной, апикальной и дорсальной его частях) и в подлежащих тканях (отдельно в области вентральнее хорды и области дорсальнее спинного мозга). Для каждого регенерата визуально обсчитывали не менее 10 срезов, полученных из центральной части регенерата. Полученные количества меченых клеток суммировали по всем срезам одного регенерата, отдельно для каждой из выбранных зон. Для бластемы и эпидермиса подсчитывали соотношение количества меченых клеток на вентральной и дорсальной сторонах регенерата (V/D). Это позволило оценить уровень «асимметрии»

пролиферативной активности клеток, а также избежать сравнения абсолютных величин.

Для эпидермиса также подсчитывали долю апикально расположенных меченых клеток от всех меченых клеток эпидермиса. Все данные обрабатывали в программах Microsoft Office Excel 2007 и STATISTICA 8.0.

Для оценки индекса мечения срезы тех же регенератов, что использовали для анализа, окрашивали ядерным флуоресцентным красителем Hoechst 33342 (Biotium, США), разведенным в PBS до концентрации 1 мкл/мл, и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DMRXA2, оснащенного фотокамерой Olympus DP70.

Срезы хвоста фотографировали при небольшом увеличении (так, что срез полностью помещался в кадре), а затем при увеличении 20, стремясь полностью охватить всю площадь среза. Далее фотографии обрабатывали с помощью программы Image J. На фотографиях среза целиком подсчитывали приблизительную площадь, занимаемую бластемой и соединительной тканью. Далее на фотографиях фрагментов среза выбирали многочисленные (обычно по 30 на срез) площадки размером 200 200 мкм и на каждой из площадок подсчитывали количество ядер и плотность расположения ядер на площадке.

На основании этих данных, а также данных об абсолютном числе меченых БрдУ + клеток в регенерате, был оценен индекс мечения.

6 Изучение апоптоза в регенератах хвоста Для выявления апоптоза использовали метод TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling), который заключается в ферментативном включении меченого dUTP в участки разрывов ДНК, образующихся при апоптозе под действием эндонуклеаз. Формировали две группы животных – субстратную и аквариальный контроль – по 9 животных в каждой группе, животных оперировали и рассаживали. Материал (по 3 образца из каждой группы) фиксировали через 24 часа после операции, на стадии регенерации I (7 дней п/оп) и II (14 дней п/оп). Ампутированную треть хвоста фиксировали в качестве интактного контроля.

Весь материал фиксировали в растворе 4% формальдегида на PBS (0,1 М, pH 7,4) и обрабатывали для получения серийных сагиттальных парафиновых срезов (5 мкм), которые окрашивали реактивами набора DeadEnd™ Fluorometric TUNEL System (Promega, США) в соответствии с рекомендациями производителя. После проведения реакции на срезах, ядра контрастировали с помощью красителя Hoechst 33342, разведенного в PBS в концентрации 1 мкл/мл. Срезы заключали под покровные стекла в смесь глицерина с PBS (9:1) с добавлением протектора флуоресценции DABCO (1,4-Diazabicyclo(2.2.2)octane – ReagentPlus®, Sigma-Aldrich, США) и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DMRXA2, оснащенного фотокамерой Olympus DP70. Изображения регистрировали с помощью программ DPController и DPManager.

7 Ингибирование сигнального пути Shh Ингибирование сигнального пути Shh проводили с помощью циклопамина (Cyclopamine, V. californicum, Calbiochem, Германия), стероидного алкалоида растения Veratrum californicum, избирательно связывающегося с белком Smoothened (Chen et al., 2002). Результатом связывания является блокирование сигнального пути Shh, что у млекопитающих приводит к терратогенному эффекту – циклопии. Чтобы отличить специфическое действие, обусловленное ингибированием Shh, от неспецифических токсических эффектов часть животных получала томатидина гидрохлорид (Tomatidine HCL, Calbiochem, Германия) – вещество, сходное по структуре с циклопамином, но не обладающее специфическим действием в отношении сигнального пути Shh (рис. 3). Все эксперименты проводили на животных, регенерирующих после ампутации дистальной 1/3 хвоста. В данных экспериментах использовали 6 групп животных: 1) не получавшие никаких фармакологических веществ и не подвергавшиеся сопутствующим манипуляциям (отрицательный контроль): аквариальный контроль и группа на субстрате, по два тритона;

2) получавшие раствор томатидина (контроль специфичности): аквариальный контроль и группа на субстрате, по три тритона; 3) получавшие раствор циклопамина (экспериментальные группы): аквариальный контроль и группа на субcтрате, по пять тритонов. В других отношениях содержание животных разных групп не различалось.

Рис. 3. Структурные формулы циклопамина (А) и гидрохлорида томатидина (Б).

Изображения взяты с сайта фирмы-производителя (http://www.merckmillipore.com).

7.1 Введение фармакологических агентов в среду Данный способ введения часто используется в экспериментах с рыбами и амфибиями; основываясь на предшествующих публикациях, мы выбрали минимальную действующую концентрацию циклопамина и томатидина, равную 0,6 мкМ (Roy, Gardiner, 2002; Schnapp et al., 2005; Taniguchi et al., 2014). Данные вещества растворяли в 96% этаноле до концентрации 300 мкМ (циклопамин) или 180 мкМ (томатидин), затем распределяли по аликвотам объемом 1 мл и хранили при температуре -20°С. В указанных публикациях фармакологическое воздействие осуществляли непрерывно, однако это не позволяет поддерживать условия содержания субстратной группы и создать строго одинаковые условия для субстратной группы и аквариального контроля. В связи с этим мы применили импульсное воздействие: животных два раза в неделю переносили в контейнеры с небольшим количеством раствора циклопамина или томатидина (из расчета 50 мл на одно животное). Для этого непосредственно перед каждым экспериментальным воздействием аликвоты растворов разводили в воде до конечной концентрации 0,6 мкМ (при этом концентрация этанола в итоговом растворе равнялась 0,2–0,3%). Инкубация в растворе длилась 180 минут, после чего животных возвращали в стандартные условия.

Животных из групп отрицательного контроля не пересаживали и не проводили ложных инкубаций. Введение ингибитора начинали со стадии сформированной бластемы перед началом дифференцировки осевых структур (21 суток п/оп), так как в предшествующих работах (Taniguchi et al., 2014) был отмечен эффект блокирования роста бластемы и практически полной остановки регенерации при введении с момента ампутации.

Эксперимент длился 49 суток, за которые животных 8 раз инкубировали в присутствии фармакологического агента. Каждые 7 суток формирующиеся регенераты фотографировали для морфометрического анализа. По окончании эксперимента фотографии обрабатывали так, как описано в разделе 2.

7.2 Внутрибрюшинное введение фармакологических агентов Для того чтобы обеспечить большую эффективность доставки фармакологических агентов в ткани был применен внутрибрюшинный способ их введения. Основываясь на примерных дозах вещества, получаемых одним животным при введении агента в среду, мы выбрали концентрацию циклопамина и томатидина, равную 12 нмоль на одно животное. Вещества растворяли в 96% этаноле до концентрации 300 мкМ (циклопамин) или 180 мкМ (томатидин), аликвотили и хранили при температуре -20°С.

Непосредственно перед введением аликвоты разводили в воде до конечной концентрации 60 мкМ. В случае циклопамина в раствор добавляли небольшое количество 96% этанола для достижения одинаковой концентрации (32%) в обоих растворах. Введение осуществляли внутрибрюшинно с помощью инсулинового шприца, объем одной инъекции составлял 200 мкл. Животные из групп отрицательного контроля ложных инъекций не получали. Инъекции проводили, начиная с 31 суток п/оп, каждые двое суток.

За время эксперимента (49 суток) животных инъецировали семь раз. Для морфометрического анализа каждые семь суток формирующиеся регенераты фотографировали. По окончании эксперимента фотографии обрабатывали, как описано в разделе 2.

8 Ингибирование белков теплового шока Ингибирование белков теплового шока проводили фармакологическим способом с использованием коммерчески доступного Heat Shock Protein Inhibitor I (Santa Cruz Biotechnology, США), также известного как KNK437 (химическая формула – N-Formylmethylenedioxy-benzylidine--butyrolactam, см. рис.1). Данное вещество ингибирует связывание фактора транскрипции HSF1 с последовательностью ДНК HSE (Nagai et al., 1995; Hansen et al., 1997; Ohnishi et al., 2004) и индуцированный тепловым шоком синтез белков HSP70, HSP72, HSP105, HSP40. Помимо этого данный ингибитор дозозависимым образом способен блокировать развитие термотолерантности в клетках млекопитающих (Yokota et al., 2000; Koishi et al., 2001). На культивированных клетках Xenopus laevis было показано вызванное ингибитором снижение уровня экспрессии мРНК Hsp30, Hsp47 и Hsp70 после теплового шока и действия химических стрессоров по сравнению с клетками, не обработанными этим агентом перед стрессовым воздействием (Manwell, Heikkila, 2007).

Рис. 4. Структурная формула молекулы KNK437 (из статьи Koishi et al., 2001).

Нами в первую очередь был проведен предварительный эксперимент для определения оптимального способа введения ингибитора и проверки эффективности выбранных по литературным данным его доз. Для этого использовали 5 групп интактных тритонов: 1) интактный контроль (Int, 4 тритона); 2) группа, подвергавшаяся тепловому шоку без воздействия ингибитора (HS, 3 тритона); 3) группа, подвергавшаяся тепловому шоку после внутрибрюшинной инъекции ингибитора (HS+ip, 3 тритона); группа, подвергавшаяся тепловому шоку после внутримышечной инъекции ингибитора (HS+im, 3 тритона); группа, подвергавшаяся тепловому шоку после наружного нанесения ингибитора (HS+ext, 3 тритона). Обработку ингибитором осуществляли за 6 часов до теплового шока, фиксация материала для выделения РНК проводилась сразу после теплового шока (по Manwell, Heikkila, 2007). Дозировки определяли, принимая во внимание данные работ на клетках млекопитающих и X. laevis (Yokota et al., 2000;

Manwell, Heikkila, 2007), где концентрация ингибитора в среде составляла 100 мкМ.

Учитывали также результаты работы на мышах in vivo (Koishi et al., 2001), в которой применялись дозировки от 62,5 до 500 мг/кг веса, а в качестве носителя было использовано оливковое масло. Последнее было выбрано нами в качестве носителя в силу отсутствия токсичности, а также большей, чем у водных растворов, вязкости, что было удобно для наружного нанесения.

Концентрация ингибитора в масле составила 50 мкг/мл (приблизительно 200 мкМ) для наружного нанесения (по 100 мкл на животное), 500 мкг/мл (приблизительно 2 мМ) для инъекций (по 100 мкл на животное). Инъекции осуществлялись с помощью инсулинового шприца, внутрибрюшинно либо внутримышечно в основание хвоста. Наружно раствор ингибитора наносили следующим способом: на хвост тритона надевалась латексная насадка, сделанная из пальца перчатки;

внутрь насадки автоматической пипеткой вносили 100 мкл раствора. Раствор распределялся по поверхности хвоста, после чего насадка фиксировалась у основания хвоста тонкой полоской клейкой ленты. Через 6 часов после обработки ингибитором все животные были подвергнуты тепловому шоку. После этого участок хвоста, взятый от стандартного уровня ампутации, был фиксирован в растворе RNA-later. Из тканей была выделена РНК и проведена ПЦР в реальном времени с использованием праймеров к последовательностям генов Hsp70 и Ef1- (см. раздел 9). В результате чего была показана высокая эффективность наружного нанесения ингибитора в блокировании стрессиндуцированной экспрессии Hsp70 по сравнению с другими способами, даже при использовании в 10 раз более низкой дозы ингибитора. Высокая степень проницаемости кожных покровов тритона для экзогенно вносимых агентов была показана в лаборатории ранее (Новикова и др., 2008). В дальнейших экспериментах использовался именно этот способ обработки.

Поскольку подобные эксперименты не были проведены ранее, нас интересовало влияние ингибитора белков теплового шока, как на нормальный ход регенерации хвоста, так и на развитие специфического морфогенетического эффекта содержания на субстрате, отмеченного нами в предыдущих экспериментах. Все эксперименты проводили на животных, регенерирующих после ампутации дистальной 1/3 хвоста. В данных экспериментах использовали 6 групп животных.

1) группа в аквариуме и группа на субстрате, не получавшие фармакологических веществ и не подвергавшиеся сопутствующим манипуляциям, (отрицательный контроль, по 3 тритона);

2) группа в аквариуме и группа на субстрате подвергавшиеся тем же манипуляциям, что и опытная группа, но получавшие только растворитель без ингибитора, (контроль специфичности, по 3 тритона);

3) группа в аквариуме и группа на субстрате, получавшие раствор ингибитора, (опытная группа, по 8 тритонов).

Сразу после ампутации животных содержали вместе в глубокой воде, так как предшествующие эксперименты показали отсутствие существенного вклада условий содержания на начальном этапе регенерации на дальнейшее развитие морфогенетических эффектов. Через 16 суток после ампутации все животные прошли начальный этап заживления раны, регенераты были сфотографированы с помощью бинокулярной камеры и прошли стандартный морфометрический анализ. На основании его результатов животные были разделены на две группы, не отличавшиеся статистически по стадии регенерации, длине регенерата и ширине его основания, углу загиба хвоста и коэффициенту загиба хвоста К. Одна из полученных групп была оставлена в глубокой воде, вторая была рассажена по контейнерам с влажным субстратом. Через 21 сутки после ампутации все регенераты достигли стадии II (Iten, Bryant, 1976a). В это время мы провели повторный морфометрический анализ регенератов, после чего группа в аквариуме, и группа на субстрате были поделены на три подгруппы (отрицательный контроль, контроль специфичности и опытную группу), не отличавшиеся друг от друга по морфометрическим показателям регенерации. Первое воздействие ингибитором было проведено в тот же день и повторялось далее каждые 2–3 суток вплоть до 47 суток после ампутации (всего 12 раз). Морфометрический анализ регенератов проводили еженедельно вплоть до 49 суток после ампутации так, как описано в разделе 2.

9 Изучение экспрессии генов Hsp70 и Hsp90 с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР)

9.1 Подготовка образцов кДНК Для изучения использовали ткани интактного хвоста (четыре образца), ткани хвоста, подвергнутого тепловому шоку (четыре образца), а также регенераты хвоста на разных стадиях в аквариальном контроле и группе на субстрате (по три образца для каждой группы через двое суток п/оп, на стадии II – 28 суток п/оп, и на стадии IV – 49 суток п/оп). Материал – около 2 мм интактного хвоста проксимальнее плоскости ампутации или регенераты с 1 мм культи – немедленно после получения взвешивали в холодном растворе 0,1 M PBS (pH 7,5), после чего переносили в раствор TRI Reagent ® RT (MRC, США) для гомогенизации ткани и выделения тотальной РНК в соответствии с рекомендациями производителя. После гомогенизации и отделения остатков клеток центрифугированием в пробирки с раствором белка нуклеиновых кислот в TRI Reagent ® RT добавляли 1/5 объема хлороформа. После расслаивания смеси отбирали содержащую РНК водную фазу, добавляли равный объем изопропанола и осаждали РНК центрифугированием. Полученный осадок отмывали очищенным 75% этанолом и хранили в нем при температуре -20°С. Для дальнейшей работы осадок высушивали, растворяли в воде, свободной от РНКаз, чистоту и концентрацию полученной тотальной РНК измеряли с помощью спектрофотометра NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, США). От примесей геномной ДНК образцы освобождали ферментом ДНКазой I (DNase I, RNase-free, Thermo Fisher Scientific, США) согласно протоколу производителя.

Инкубацию с ферментом проводили в течение 30 мин при 37°С. Для ингибирования фермента добавляли ЭДТА до конечной концентрации 2,3 мМ и инкубировали при температуре 65°С 15 мин. После этого немедленно приступали к синтезу первой цепи кДНК с помощью набора для проведения обратной транскрипции «Синтез первой цепи кДНК (рэндом)» (Силекс, Россия), содержащего случайные гексапраймеры. В соответствии с рекомендациями производителя, в первую очередь производили отжиг матрицы с гексапраймерами при 70°С в течение 10 мин. После добавления в пробирки реакционного буфера, смеси нуклеотидов и обратной транскриптазы M-MLV, смесь инкубировали 10 минут при 25°С, а затем 1 час при 37°С. Реакцию останавливали прогреванием до 70°С в течение 10 мин, а полученную кДНК хранили при -20°С. В ходе работы было выяснено, что для эффективной инактивации ДНКазы I недостаточно прогрева до 70°С, что проявляется в низком и нестабильном выходе кДНК. Введение дополнительного шага – прогревания смеси при температуре 95°С в течение 15 мин после остановки реакции обратной транскрипции – позволило полностью устранить данную проблему. В результате были получены кДНК библиотеки интактного хвоста тритона, тканей хвоста после теплового шока, а также регенератов хвоста через 2 суток после операции и на стадиях регенерации II и IV. Концентрация кДНК во всех библиотеках была измерена спектрофотометрически и доведена до стандартных значений – 500 нг/мкл для сток-растворов и 125 нг/мкл для рабочих разведений. Данная концентрация кДНК была выбрана с учетом рекомендаций по работе на амплификаторах фирмы Applied Biosystems, исходя из следующих значений: концентрация кДНК в реакционной смеси 5 нг/мкл, объем реакционной смеси 25 мкл, объем добавляемого в реакционную смесь раствора кДНК 1 мкл.

9.2 Полуколичественная ПЦР Полуколичественную оценку экспрессии генов Hsp70 и Hsp90 проводили методом ОТ-ПЦР на матрице кДНК; в качестве внутреннего контроля были выбраны гены Ef1-, Gapdh и -Actin. Праймеры для ПЦР (см. табл. 1) были сконструированы на основе нуклеотидных последовательностей, аннотированных в международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank), и сервиса для сравнительного анализа нуклеотидных и белковых последовательностей BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Для проведения ПЦР использовали набор для амплификации «Амплификация ДНК с ColoredTaq полимеразой» (Силекс, Россия) и амплификатор Eppendorf Mastercycler 5532 (Eppendorf, Германия).

Концентрация прямого и обратного праймеров в реакционной смеси составляла по 0,4 мкМ. Для проведения ПЦР с праймерами для гена Gapdh температура отжига составляла 56°С, со всеми остальными праймерами – 63°С при 40 циклах амплификации. Температурный режим реакции определяли теоретически, используя возможности программы Beacon Designer (Premier Biosoft International, США), а затем проверяли экспериментально, проводя пробные ПЦР с шагом в 2°С в диапазоне ±4°С от расчетной температуры. ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в 1,5% агарозном геле (Amresco, США) в TAE буфере (Tris Acetate-EDTA buffer, 10x concentrate, Sigma-Aldrich, США). Для оценки длины фрагментов использовали маркер длин фрагментов 100–1000 п.н. (Силекс, Россия). Качественную оценку интенсивности свечения продуктов ПЦР проводили на УФ-трансиллюминаторе Gel

Doc™ XR+ System (BIO-RAD, США) с помощью программы QuantityOne (BIO-RAD,США).

Продукты ПЦР, полученные с использованием специфических праймеров к нуклеотидной последовательности и секвенировали. Процедура Hsp70 Hsp90, секвенирования выполнялась в компании СИНТОЛ (Россия). Полученные последовательности анализировали с использованием набора программ пакета Lasergene (DNASTAR) (Авдонин и др., 2013) и сервиса BLAST и проверяли на соответствие последовательностям в базе данных GenBank, использованным для конструирования праймеров.



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 7 |
 

Похожие работы:

«Моторыкина Татьяна Николаевна ЛАПЧАТКИ (РОД POTENTILLA L., ROSACEAE) ФЛОРЫ ПРИАМУРЬЯ И ПРИМОРЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Н.С. Пробатова Хабаровск Содержание Введение... Глава 1. Природные...»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Сухарьков Андрей Юрьевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, Метлин Артем Евгеньевич Владимир 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя бешенства 2.2 Эпизоотологические...»

«СЕТДЕКОВ РИНАТ АБДУЛХАКОВИЧ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ Юсупов...»

«МИГИНА ЕЛЕНА ИВАНОВНА ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ТРИЛАКТОСОРБ В МЯСНОМ ПЕРЕПЕЛОВОДСТВЕ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Кощаев Андрей...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«КОЖАРСКАЯ ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАРКЕРОВ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук, Любимова Н.В. доктор медицинских наук, Портной С.М. Москва, 2015 г....»

«Палаткин Илья Владимирович Подготовка студентов вуза к здоровьесберегающей деятельности 13.00.01 общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,...»

«Петухов Илья Николаевич РОЛЬ МАССОВЫХ ВЕТРОВАЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЛЕСНОГО ПОКРОВА В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ (КОСТРОМСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.08 экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.В. Шутов...»

«Мансуров Рашид Шамилович Применение препарата Солунат при выращивании бройлеров 06.02.08. – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки Российской...»

«Ядрихинская Варвара Константиновна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В Г. ЯКУТСКЕ И РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент М.В. Щелчкова Якутск 2015...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«Любас Артем Александрович ПАЛЕОРЕКОНСТРУКЦИЯ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ В НЕОГЕН-ЧЕТВЕРТИЧНЫХ ВОДОТОКАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ПРИРОДНЫМИ УСЛОВИЯМИ Специальность 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель: доктор биологических наук...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Степина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ФЛОРИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЮГО-ЗАПАДНЫХ РАЙОНОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«АБДУЛЛАЕВ Ренат Абдуллаевич ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МЕСТНЫХ ФОРМ ЯЧМЕНЯ ИЗ ДАГЕСТАНА ПО АДАПТИВНО ВАЖНЫМ ПРИЗНАКАМ Шифр и наименование специальности 03.02.07 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«ШУБНИКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И ФОРМ АДАПТИВНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ К ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ 03.02.03 –...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.