WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |

«РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ ...»

-- [ Страница 2 ] --

Тканевая регенерация идет в пределах поврежденной мышцы за счет присутствующей в ней резервной клеточной популяции. При эпиморфной регенерации вначале происходит формирование бластемы – массы морфологически малодифференцированных клеток, возникших из разных источников в результате дедифференцировки. Затем эти клетки специализируются и образуют ткани, в том числе и мышечную ткань, de novo. Подробная сравнительная характеристика этих двух типов регенерации дана Брюсом Карлсоном (обзор Carlson, 2002). Оба типа регенерации присущи хвостатым амфибиям и часто обеспечивают восстановление одного и того же повреждения. Например, при регенерации хвоста амфибий в пределах поврежденных миомеров культи имеет место тканевое восстановление, а мышцы регенерата образуются эпиморфным способом из регенерационной бластемы (Carlson, 1970; Dinsmore, 1977; Mufti, 1973).

5.1 Тканевая регенерация и резервные клеточные популяции В мышцах позвоночных животных, в том числе человека, существует резервная популяция клеток, служащая для репаративной регенерации мышц и увеличения мышечной массы в онтогенезе по мере взросления особи, а также под действием функциональной нагрузки. С функциональной точки зрения резервные клетки (сателлитные клетки) – соматические унипотентные стволовые клетки. Морфологически они представляют собой небольших размеров одноядерные клетки на периферии многоядерных мышечных волокон и располагаются непосредственно под базальной мембраной. «Молчащие» сателлитные клетки сохраняют состояние, присущее ранним стадиям миогенной дифференцировки, и не экспрессируют миогенных регуляторных факторов семейства MyoD. После повреждения, однако, экспрессия этих факторов запускается, клетки мигрируют в зону повреждения и вступают в клеточный цикл. Путем ассиметричных делений восстанавливаются пулы миобластов и «молчащих» сателлитных клеток. Сформированные миобласты сливаются, образуя вначале мышечные волокна с центрально локализованными ядрами, которые затем дифференцируются, формируя нормальную архитектуру скелетной мышцы. В ходе тканевой регенерации происходит перестройка внеклеточного матрикса, который играет важную структурную роль и выступает в качестве регулятора морфогенеза (Martin et al., 2006).

Тканевая регенерация имеет место у хвостатых амфибий при иссечении мышц in vivo (Cameron, 1983), а также культивировании рассеченных мышечных волокон in vitro (Schrag, Cameron, 1983; Cameron et al., 1986). Эти опыты доказывают существование резервной клеточной популяции в мышцах тритонов и возможность регенерации мышц без участия клеток бластемы и процесса дедифференцировки. Но, в то же время, было показано, что у тритонов клеточный резерв для тканевой регенерации мышц организован не так, как у других позвоночных: в мышцах взрослых особей собственно сателлитных клеток нет. Клетки, подобные сателлитным, присутствуют не под базальной мембраной мышечного волокна, а снаружи от нее, окруженные собственной базальной мембраной.

Эти клетки считались сначала перицитами сосудов, способными проходить миогенную дифференцировку (т.н. «перициты» Popiela – цит. по Cameron et al., 1986), затем потомками сателлитных клеток («постсателлитные клетки» Черкасовой (Черкасова, 1982)) и свободными клетками («free cells» Takahama (Takahama et al., 1984)). Собственно сателлитные клетки присутствуют только у личинок тритонов, однако с развитием их количество уменьшается, а их потомки проходят начальные этапы дифференцировки по миогенному пути, становясь «постсателлитными клетками» (Takahama et al., 1984).

5.2 Эпиморфная регенерация и дедифференцировка мышечных волокон В опытах Динсмора (Dinsmore, 1981) по одностороннему удалению мягких тканей хвоста и последующей ампутации хвоста на более дистальном уровне было показано, что мягкие ткани культи не оказывают влияния на эпиморфную регенерацию. У тритонов, прошедших такую процедуру, полноценный регенерат развивался на ассиметричной культе, одна из сторон которой была лишена мышц. Эти опыты показывают, что мышцы культи и регенерата регенерируют разными путями, что согласуется с цитированными выше предположениями Карлсона и Муфти о том, что при регенерации хвоста мышцы культи не участвуют в образовании бластемы. Эта ситуация существенно отличается от таковой в регенерирующей конечности, где аналогичное воздействие приводит к образованию видоизмененного регенерата. Общепризнано, что при регенерации конечности, поврежденные мышечные волокна распадаются на одноядерные клетки, восстанавливают способность вступать в клеточный цикл и теряют, хотя бы отчасти, признаки миогенной дедифференцировки. Образующиеся клетки составляют заметную часть регенерационной бластемы – попытка количественной оценки их вклада дала значение 17% (Echeverri et al., 2001).

Принимая во внимание данные Динсмора, Карлсона и Муфти о том, что мышцы культи не вносят вклад в образование бластемы хвоста тритона, клеточный источник для образования мышц в регенерате хвоста остается не ясным. Имеет ли здесь место трансдифференцировка бластемных клеток соединительнотканного происхождения, миграция и пролиферация миобластов культи, вклад в образование бластемы резервных клеток мышц культи или какой-либо другой процесс? Возможно, в пределах культи судьба поврежденных мышечных волокон неодинакова. Это подтверждается работой по исследованию распределения дистрофина и ламинина в регенерирующем хвосте тритона (Arsanto et al., 1992). В культе медиальные сгруппированные мышечные волокна окрашиваются антителами и к дистрофину, и к ламинину, а более латеральные – только антителами к дистрофину, что скорее говорит в пользу их дедифференцировки, нежели отражает образование мышц из клеток-предшественников. Таким образом, не исключено, что латеральные мышечные волокна образуют некоторое количество дедифференцированных одноядерных клеток, способных участвовать в образовании бластемы. С этим согласуются и данные о том, что в зоне эпиморфного влияния ингибируются процессы тканевой регенерации (Carlson, 2002). С другой стороны, в 2004 году появились данные о возможной роли резервных клеток мышц в формировании бластемы. На модели регенерации хвоста X. laevis (Gargioli, Slack, 2004) и конечности тритона (Morrison et al., 2006) было показано, что в мышцах присутствует популяция клеток, морфологически аналогичных «постсателлитным клеткам» Черкасовой (Черкасова, 1982), которые экспрессируют маркер сателлитных клеток Pax7, активно пролиферируют и через некоторое время после ампутации оказываются в регенерационной бластеме. Очевидно, что в этом случае дедифференцированные клетки должны обладать выраженной способностью к миграции. Эта способность поддерживается в зоне эпиморфной регенерации за счет активной реэкспрессии тенасцина

– гликопротеина внеклеточного матрикса, способного модулировать адгезию клеток к субстратам. Обычно он обнаруживается в матриксе мезенхимы при активной миграции и пролиферации относительно недифференцированных клеток. На ранних стадиях регенерации заметно увеличивается его содержание в мезенхиме бластемы, возможно, в ответ на сигналы раневого эпителия (Arsanto et al., 1990).

6 Регенерация нервной системы Морфологические изменения, сопровождающие восстановление периферической и центральной нервной системы при регенерации хвоста у взрослых тритонов, достаточно детально описаны (Iten, Bryant, 1976a). На стадии I регенерации спинной мозг оканчивается приблизительно на 0,25–0,5 мм проксимальнее плоскости ампутации.

Эпендимный эпителий спинного мозга в зоне разреза закрывается, формируя небольшой «терминальный» пузырек. В это время в каудальной части эпендимного эпителия митотические фигуры не наблюдаются. Оболочки спинного мозга вытягиваются до достижения контакта с раневым эпителием. Окружающая спиной мозг рыхлая соединительная ткань претерпевает дезорганизацию. Во время стадии II, по мере роста регенерата эпендимная трубка с терминальным пузырьком на конце растет в каудальном направлении. В это время в эпендимной трубке уже наблюдаются многочисленные митотические фигуры, а вокруг начинается образование краевого слоя клеток. К стадии III спинной мозг отстоит от апикального эпителия регенерата только на 0,1 мм, а число окружающих его слоев клеток («мантийная», покровная область) в проксимальной зоне увеличивается до двух. В начале стадии IV эта зона спинного мозга насчитывает уже 2–3 слоя клеток, и по всей длине эпендимного эпителия по-прежнему наблюдаются митотические фигуры. Вокруг наиболее проксимальной части регенерата образуются оболочки мозга, являющиеся продолжением оболочек в культе.

Использование флуоресцентных маркеров позволило определить, какие именно клетки образуют эпендимную трубку и, впоследствии, весь спинной мозг регенерата.

Выяснилось, что клетки, непосредственно прилегающие к плоскости ампутации, погибают и уничтожаются фагоцитами (вероятно, из-за этого в течение первой стадии регенерации между апикальным концом спинного мозга и плоскостью ампутации образуется некоторый промежуток) (Zhang et al., 2003). Большую часть будущего спинного мозга составят клетки, находящиеся в зоне длиной 500 мкм проксимальнее плоскости ампутации, которые пролиферируют и мигрируют вдоль передне-задней оси (Mchedlishvili et al., 2007). Основной вклад в развитие эпендимной трубки вносят радиальные эпендимные клетки, однако показано, что нейроны, уже содержащиеся в этой области, могут мигрировать в дистальном направлении, принимая участие в формировании функционального спинного мозга (Zhang et al., 2003).

Интересно, что капилляры вокруг регенерирующего спинного мозга являются прерывистыми, причем не только на ранних стадиях регенерации, но и спустя 2 месяца после ампутации. Таким образом, во время регенерации хвоста гематоэнцефалический барьер до конца не сформирован и не вполне эффективен, и, наоборот, возможности для обмена метаболитами и ростовыми факторами между нервной тканью и кровью очень велики (Lorenzo, 1992).

Во время стадии I нервы, выходящие из наиболее каудальных спинальных ганглиев, дезорганизованы и оканчиваются на том же уровне, что и спинной мозг. В ходе последующих стадий восстановление периферической нервной системы включает формирование вентральных и дорсальных корешков спинного мозга, формирование спинальных ганглиев, рост нервов и установление иннервации тканей регенерата.

Установление иннервации тканей происходит за счет двух основных источников: вопервых, аксонов и нервов, прорастающих в регенерат из культи; во-вторых, аксонов и нервов, вновь образованных в процессе регенерации из материала эпендимной трубки. На стадии II раневой эпителий уже иннервирован, дорсальные и вентральные ветви спинальных ганглиев, расположенных вблизи плоскости ампутации, начинают врастать в формирующуюся бластему. На стадии III нервы привлекаются в область дегенерации мышечных волокон, а к стадии IV образуют нервно-мышечные соединения с краями дифференцированных мышечных волокон (Iten, Bryant, 1976; Thouveny et al., 1991).

6.1 Потенции эпендимных клеток Таким образом, было установлено, что при регенерации формируется эпендимная трубка, дающая начало как спинному мозгу, так и периферической нервной системе. В каких же направлениях дифференцировки могут развиваться клетки эпендимного эпителия? Опыты по мечению и трансплантации в регенерат клеток первичной культуры зрелого спинного мозга показали, что клетки, в культуре идентифицирующиеся как эпендимоглиальные, в трансплантате дифференцируются в меланоциты и Шванновские клетки (Benraiss et al., 1996; 1997). В работе 1997 года (Benraiss et al., 1997) показано, что цитоархитектура терминального пузырька предполагает выход клеток за его пределы. В подтверждение этого, в мезенхиме вокруг терминального пузырька обнаружены скопления клеток, идентифицируемых как эпендимоглиальные (8 дней регенерации), а на более поздних стадиях (2–4 недели) выявлена дифференцировка этих клеток в меланоциты и Шванновские клетки. Таким образом, по крайней мере, каудальная часть эпендимной трубки обладает частью потенций нервного гребня и способна дифференцироваться по пути меланоцитов или Шванновских клеток.

Эксперименты с двойной меткой предшественником синтеза ДНК бромдеоксиуридином (БрдУ) и антителами к глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP, glial fibrillary acidic protein), а также БрдУ и антителами к нейрон-специфической энолазе (NSE, neuron-specific enolase) антителами, показывают, что в эпендимном слое клетки активно делятся. При этом, в ростральном и медиальном отделах эпендимной трубки обнаруживаются как NSE+ нейроны, так и GFAP+ глия.

Кроме того, в культурах спинного мозга регенератов хвоста наблюдается процесс нейрогенеза – наличие БрдУ метки в клетках, идентифицируемых в качестве нейронов на основании их морфологии и мечения анти-NSE антителами. Таким образом, нейральная дифференцировка в культурах спинного мозга регенератов хвоста происходит не только за счет изначально присутствовавших в эксплантате нейронов, но и за счет активного деления и дифференцировки эпендимных клеток. На этом основании было сделано предположение о бипотентном предшественнике нейронов и глиальных клеток в эпендимной выстилке спинного мозга хвостатых амфибий (Benraiss et al., 1999).

Путем мечения нейральных прогениторных клеток было показано, что большинство клеток из дистальной зоны спинного мозга пролиферируют и мигрируют вдоль передне-задней оси, оставаясь на изначальном уровне по дорсовентральной (Mchedlishvili et al., 2007). Поскольку спинной мозг структурирован в дорсовентральной плоскости за счет дифференциальной экспрессии генов, контролируемой градиентами BMP и Shh (Schnapp et al., 2005), клетки в пределах одного домена формируют одинаковые типы нейронов. Однако были отмечены и случаи перехода между доменами, то есть образования разных типов нейронов из одного мультипотентного нейрального предшественника. Большинство таких переходов происходило в зоне терминального пузырька. В сочетании с фактом, что клетки терминального пузырька не экспрессируют маркеров дорсовентральных доменов (в данной работе – Pax6, Pax7), это позволяет предположить, что в дистальной области регенерата происходит дедифференцировка нейральных прогениторных клеток (Mchedlishvili et al., 2007). В итоге они приобретают потенции не только к образованию нескольких типов нейронов, но также способность к эпителиально-мехенхимному переходу, миграции в бластему и дифференцировке в Шванновские клетки, меланоциты (Benraiss et al., 1997), а также хрящ и мышцы (Echeverri, Tanaka, 2002).

Удивительные результаты были получены в опытах Эчеверри и Танака (Echeverri, Tanaka, 2002). В регенерирующем хвосте аксолотля индивидуально помеченные зеленым флуоресцентным белком (GFP, green fluorescent protein) нейральные предшественники – клетки радиальной глии – покидали спинной мозг и принимали участие в формировании мышц и хряща в 20% и 8% случаев, соответственно. Этот пример переключения между клеточными типами, принадлежащими к разным зародышевым листкам, показывает, что как минимум некоторые клетки спинного мозга хвостатых амфибий способны к глубокой дедифференцировке и возврату к плюрипотентному состоянию.

6.2 Регуляторная роль эпендимных клеток Предполагается, что ключом к ответу на вопрос о причинах уникальных регенерационных возможностей нервной системы хвостатых амфибий является способность эпендимы их спинного мозга специфически реагировать на повреждение. Эта реакция включает, во-первых, приобретение потенций эмбрионального нейроэпителия;

во-вторых, специфическое взаимодействие с другими клетками; в-третьих, специфическое преобразование окружающего внеклеточного матрикса (ВКМ) (Chernoff, 1996).

Эпендимные клетки хвостатых амфибий способны к активной пролиферации и (как минимум, часть их) к дифференцировке по нейральному или глиальному типу (Benraiss et al., 1996; 1997). Для объяснения этих способностей были высказаны два предположения: о существовании в эпендиме клеточных субпопуляций, компетентных к дифференцировке по тому или иному типу, и о способности клеток эпендимы дедифференцироваться, приобретая свойства мультипотентных стволовых клеток. В настоящее время вторая версия представляется более доказанной (Ferretti, 2004). Предполагается, что дедифференцировка оказывается возможной благодаря «эмбриональному характеру» их эпендимы. Для нее характерен ряд свойств, свидетельствующих о низком уровне дифференцировки клеток. Ими являются:

1) сохранение клеточных контактов с базальной мембраной pia matter (глиальной внутренней мембраной);

2) экспрессия во взрослом состоянии генов эмбриональных цитокератинов (8 и 18);

3) способность клеток к синтезу эмбриональной полисиалированной формы молекул клеточной адгезии нейральных клеток PSA-N-CAM (см. ниже) (Chernoff, 1996);

4) способность к реэкспрессии маркеров нейральных стволовых клеток – виментина и нестина (Walder et al., 2003).

По-видимому, экспрессия цитокератинов 8, 18, хотя и свидетельствует в пользу «незрелости» эпендимы бесхвостых амфибий, не имеет отношения к их регенерационной способности. Это подтверждается, во-первых, тем, что в ряду позвоночных экспрессия всех перечисленных молекул филогенетически никак не коррелирует с регенерационной способностью (Chernoff, 1996), и косвенно тем, что у мышей, нокаутных по генам нейрофиламентов, нет очевидных нарушений аксоногенеза (Julien, 1999). «Стволовый»

характер эпендимных клеток при регенерации связан с высокой активностью в них сигнального пути Notch-1, который опосредованно (через Notch-1 рецептор и ген Hes) ингибирует гены нейральной дифференцировки – Mash и neurogenin. В регенерирующем спинном мозге хвостатых амфибий активно экспрессируется ген Nrp-1, ответственный за поддержание Notch-1 каскада. Характерно, что у взрослых X. laevis при потере регенерационной способности спинного мозга экспрессия этого гена прекращается.

Установление высокого пролиферативного статуса эпендимных клеток происходит под влиянием ростовых факторов, выделяемых как самими клетками, так и их окружением.

Так, при регенерации наблюдается высокий уровень экспрессии митогенного фактора Fgfв эпендиме и бластеме. В культуре клеток аксолотля другой ростовой фактор – EGF – поддерживает пролиферацию и миграцию эпендимных клеток. На других системах показано индуцируемое FGF-2 появление клеточных рецепторов к EGF (Chernoff et al., 2003).

Эпендимные клетки взаимодействуют между собой, а также с нейронами, астроцитами и олигодендроцитами (Chernoff, 1996). Эпендимоглиальные и Шванновские клетки играют роль в формировании нейронных путей (neuronal pathfinding), сопровождая и стабилизируя пионерные аксоны, отрастающие по направлению к миомерам.

Поверхность эпендимных клеток, образующая эти каналы, содержит отростки, которые делят аксоны на мелкие группы. Кроме того, ее мембрана формирует разного строения контакты с аксонами: при входе аксонов в канал – полудесмосомы, дальше по каналу – синапсоподобные контакты. Их роль – направление аксонов, поставка субстрата для роста и, возможно, обмен более специфичными факторами с аксонами (Nordlander, Singer, 1978). На поверхности эпендимоглиальных клеток и в аксональных компартментах интенсивно синтезируется эмбриональная форма молекулы клеточной адгезии PSA-NCAM. Стерическая конформация PSA-N-CAM затрудняет гомофильное связывание других молекул клеточной адгезии, играя роль негативного регулятора взаимодействий клеток с субстратом и между собой и обеспечивая возможность деления и миграции эпендимоглиальных и нервных клеток, а также длительного роста аксонов (Caubit et al., 1993). Культивирование нейронов в среде с фактором роста нервов NGF (nerve growth factor) и сокультивирование с мезенхимными эпендимными клетками показывает, что эпендима выделяет какие-то дополнительные диффундирующие факторы, обладающие нейротропным эффектом (Chernoff, 1996). Одним из факторов, выделяемых эпендимными клетками, может быть ретиноевая кислота (РК). Накоплено много данных о ее влиянии на развитие нервной системы позвоночных. Например, известно, что РК стимулирует рост аксонов и регулирует (как и ретинол) способность клеток к миграции. Предполагается, что, захватывая ретинол, глиальные клетки могут метаболизировать его до РК, а РК, в свою очередь, является хемоаттрактантом, определяющим рост комиссуральных аксонов в направлении вентральной пластинки (Maden, Holder, 1991). Кроме того, предполагается, что эпендимные клетки продуцируют нейротрофические факторы, стимулирующие выживание нейронов и рост аксонов.

К таким фактором относятся NGF, выделенный из мозга нейротрофический фактор (BDNF, brain-derived neurotrophic factor), нейротрофин-3 нейротрофин-4/5 цилиарный (neurotrophin-3, NT-3), (neurotrophin-4/5, NT-4), нейротрофический фактор (CNTF, ciliary neurotrophic factor), холинергический фактор нейрональной дифференцировки/фактор ингибирования лейкемии (CDF/LIF, cholinergic neuronal differentiation factor/leukemia inhibitory factor) (Chernoff, Stocum, 1995). Не имеет окончательного ответа и вопрос о наличии в спинном мозге амфибий настоящих фиброзных астроцитов: классическим маркером этих клеток считается GFAP, который присутствует в базальной части радиальных отростков эпендимоглии. Так или иначе, при повреждении спинного мозга у амфибий, в отличие от млекопитающих, не образуются ни астроцитарные рубцы, формируемые GFAP-позитивными клетками, ни фибробластные рубцы, формируемые клетками из мозговых оболочек. Олигодендроциты встречаются в периэпендимном слое зрелого спинного мозга и базальнее; они формируются в вентральной части спинного мозга, индуцируемые хордой. Олигодендроциты могут осуществлять как позитивный (ремиелинизация новых аксонов), так и негативный контроль регенерации спинного мозга (выработка токсичных продуктов распада миелина). К таким продуктам относятся хондроитинсульфат протеогликан, тенасцин-Р и миелин-ассоциированный гликопротеин, ингибирующие регенерацию нейронов у млекопитающих. Все они присутствуют у амфибий и после травмы быстро удаляются (Chernoff et al., 2003).

Наконец, эпендимные клетки способны специфически перестраивать внеклеточный матрикс, который служит важнейшим регулятором многих процессов при регенерации.

Взаимодействие клеток с ВКМ регулирует тенасцин – фактор, синтезирующийся радиальной эпендимоглией в развивающемся и регенерирующем спинном мозге. Этот фактор предположительно играет роль субстрата для миграции нейронов и формирования аксональных компартментов (Caubit et al., 1994). Показано, что сигнализация через молекулы ВКМ требуется для процессов выхода из эпендимной трубки, роста и направления аксонов мотонейронов (за счет ориентированных фибрилл коллагена и ассоциированного с ними тенасцина). Сегментный характер иннервации может быть связан с организацией миосепт, по которым мигрируют нейроны, и регуляторной ролью тенасцина, содержащегося в них в больших количествах (Thouveny et al., 1993). В эпендимных клетках начинают продуцироваться матриксные металлопротеиназы (MMPs,

– ферменты, отвечающие за деградацию коллагенов, matrix metalloproteinases) фибронектина, ламинина и протеогликанов, и прекращается синтез тканевого ингибитора металлопротеиназ (TIMP-1, tissue inhibitor of MPs), характерный для зрелого спинного мозга. По-видимому, эти ферменты играют важную роль в деградации коллагена, входящего в состав мозговых оболочек и глиальной пограничной мембраны. Разрушение хондроитин-сульфат протеогликанов и тенасцина ингибирует астроцитарный глиоз, являющийся причиной образования глиального рубца (Chernoff et al., 2003).

До конца не выяснено, на какие именно сигналы реагирует эпендимная клетка поврежденного спинного мозга. Предполагается, что таким сигналом может служить изменение внутриклеточного уровня кальция. При повреждении спинного мозга в клетках происходит кальциевый всплеск, приводящий к разворачиванию процесса эсайтотоксичности и, далее, к гибели нейронов и астроцитов. Показано, что повышение уровня кальция в индивидуальных астроцитах влечет за собой проявление кальцийопосредованных токсических эффектов в окружающих астроцитах и нейронах.

Обсуждается способность эпендимных клеток блокировать распространение этих эффектов за счет поглощения кальция самими клетками, которое одновременно защищает окружающие клетки и может провоцировать запуск эпендимного ответа через систему вторичных мессенджеров. Известно, что в развитии амфибий кальций играет роль порогового фактора, контролирующего нейрональную дифференцировку; возможно, схожим образом контролируется судьба эпендимных клеток при регенерации спинного мозга (Chernoff et al., 2003).

7 Механизмы регуляции морфогенеза хвоста Недавние исследования (Schnapp et al., 2005) показали, что в хвосте Urodela существует дорсовентральная позиционная информация, контролирующая регенерацию после ампутации. В основе этой информации лежат дорсовентральные отличия в спинном мозге, которые могут быть описаны в терминах молекулярной биологии. Выяснено также, что эти отличия «диктуют» план строения и окружающих тканей, в частности хряща и мышц. Интересно, что эта информация поддерживается и реализуется при регенерации хвоста в течение всей жизни животных. Предполагается, что этот феномен является залогом высокой способности к регенерации. Морфогенетический контроль при регенерации хвоста у Urodela осуществляется и в передне-заднем направлении и также может быть описан в терминах молекулярной биологии. Ниже рассмотрены основные молекулярно-генетические механизмы, опосредующие передне-заднюю и дорсовентральную полярность регенерата.

7.1 Передне-задняя полярность Для регенерации хвоста у Urodela необходимы координированный рост и развитие тканей разных типов, включая спинной мозг, позвоночник и мышцы. Известно, что корректная пространственная и временная экспрессия Hox-генов обеспечивает в развитии пространственную организацию туловища, хвоста и конечностей, но во взрослом состоянии большинство этих генов не экспрессируется (Chernoff et al., 2003). При регенерации хвоста у тритона многие гены семейства Hox возобновляют свою работу.

Так, гены Hoxb13, Hoxc10 (Carlson et al., 2001), PwHoxc13, PwHoxc12 (Nicolas et al., 2003) реэкспрессируются в регенерирующем спинном мозге на значительно более высоком уровне, чем в зрелой ткани, соблюдая правило пространственной коллинеарности, что свидетельствует об их потенциальной роли носителей позиционной информации в регенерации и, особенно, в формировании передне-задней оси регенерата. Реэкспрессия генов и характеризуется краниокаудальным градиентом с PwNkx3.3 PwNkx3.2 максимумом в каудальной области. При регенерации они активно реэкспрессируются также в раневом эпидермисе, в регенерирующих мышцах, нервной трубке, спинальных ганглиях и хряще и могут играть особенно важную роль в регенерации скелетных структур (Nicolas et al., 1999).

В процессе регенерации используются некоторые молекулярные механизмы эмбрионального развития, в частности те, что определяют морфогенез зародыша. Многие исследователи рассматривают регенерацию как следствие реактивации генов, детерминирующих развитие, и для такого мнения есть достаточно оснований. Таким примером является семейство транскрипционных факторов Wnt, играющих важную роль в формировании вторичной и первичной осей зародыша. Многие гены семейства Wnt продолжают свою работу на невысоком уровне и в интактном спинном мозге хвостатых амфибий. При регенерации хвоста происходит «up»-регуляция работы этих генов: гены Pwnt-10a (Caubit et al., 1997a), Pwnt-5a, Pwnt-5b (Caubit et al., 1997b) экспрессируются на высоком уровне в бластеме, при этом с максимумом экспрессии в самой каудальной зоне.

В эпидермисе регенерата хвоста также повышается уровень экспрессии Pwnt-7a, который в норме активен в коже зрелого хвоста (Caubit et al., 1997b). Такое распределение предполагает участие генов семейства Wnt в поддержании регенерационной способности тканей хвостатых амфибий.

7.2 Дорсовентральная полярность Механизмы формирования дорсовентральной полярности важны, в частности, для корректного роста аксонов к клеткам мишеням и специализации регенерирующих мотонейронов. В нервной трубке можно выделить домены, для которых характерна экспрессия серий гомеодомен-содержащих и paired box-содержащих транскрипционных факторов. Наиболее дорсальный домен определяется экспрессией Msx1 и Msx2, дорсолатеральные – экспрессией Pax7, латеральные – экспрессией Pax6, а наиболее вентральная часть – экспрессией Nkx6.

1 и Nkx2.2 (рис. 4). Экспрессия этих транскрипционных факторов контролируется противонаправленными градиентами морфогенов – вентрализующим градиентом Shh (sonic hedgehog) и дорсализующим градиентом BMP (bone morphogenic protein). Shh – внеклеточный сигнальный фактор, синтезирующийся в хорде и дне спинного мозга. Градиент концентрации Shh определяет формирование двух различных молекулярных доменов. Экспрессия гомеотических генов типа I (Pax7, Irx3, Dbx1, Dbx2, Pax6) ингибируется в присутствии Shh, в то время как экспрессия гомеотических генов класса II (Nfx6.1, Nkx2.2) активируется. Градиенту Shh противопоставлен градиент BMP, семейства регуляторных молекул, синтезирующихся в эктодерме и крыше спинного мозга. BMP4 и BMP7 активируют экспрессию генов Msx1, Pax7, Pax6 в дорсальной и латеральной части нервной трубки. Эти домены присутствуют как в развивающемся спинном мозге, так и в эпендимной трубке регенерата. В развитии дорсовентральная организация нервной трубки определяется сигналами от окружающих мезодермальных тканей (Wilson, Maden, 2005), а при регенерации – позиционной информацией, содержащейся во взрослом спинном мозге (Schnapp et al., 2005). Передача сигнала опосредуется генами и которые регулируют Shh Gli1, Gli2 Gli3, транскрипционные факторы AxFKH1 и AxFKH2. Те в свою очередь активируют продукцию маркеров дна спинного мозга (Jacob, Briscoe, 2003), возможно Nkx6.1 и Nkx2.2 (Schnapp et al., 2005). Определение в спинном мозге молекулярных доменов по дорсовентральной оси является основой формирования разных подтипов нейронов в определенной локализации.

К числу других генов, обеспечивающих детерминацию прогениторных клеток и судьбу нейронов спинного мозга, относятся гены, кодирующие транскрипционные факторы Math1, Mash1 и neurogenin, образующие сложную систему взаимного ингибирования (Chernoff et al., 2003). Ген PwDlx3 выявляется в эпендимных клетках, восстанавливающих ганглии дорсальных корешков, и представляет пример адресной экспрессии морфогена (Nicolas et al., 1996). Гены семейств Shh и Bmp играют важную роль не только в структурировании спинного мозга, но и в регуляции клеточной пролиферации, организации «плана строения» и спецификации клеточных типов в пределах производных сомитов. Shh индуцирует формирование хряща с вентральной стороны от эпендимной трубки, а также регулирует миогенную дифференцировку клеток, активируя экспрессию Myf5 (Schnapp et al., 2005).

Рис. 4. Схема формирования молекулярных доменов, определяющих дорсовентральную структуру спинного мозга и окружающих тканей.

7.3 Эпигенетические регуляторы регенерации и морфогенеза В последние годы интенсивно развиваются исследования в области эпигенетики – наследуемых изменений в генной активности и экспрессии, не обусловленных изменением последовательности ДНК. Эпигенетика является одной из наиболее быстро развивающихся областей наук, тесно связанной с актуальными проблемами биологии развития. К эпигенетическим механизмам относят метилирование ДНК, модификации гистонов, активность малых и некодирующих РНК. Эпигенетические модификации играют решающую роль в упаковке и считывании генома под влиянием физиологических факторов. Эти механизмы, так же как и другие факторы регуляции транскрипции, в конечном итоге регулируют активность и экспрессию генов во время развития и дифференцировки, или в качестве ответа на воздействия внешней среды. Эпигенетические исследования направлены на решение вопросов о том, как клетки, несущие идентичный геном, дифференцируются в разные клеточные типы, как поддерживается дифференцированное состояние клетки.

МикроРНК выполняют множество функций в развитии животных, и многие из них являются чрезвычайно консервативными. Животные, не имеющие микроРНК (например, мутантные по белку Dicer), гибнут на ранних стадиях эмбрионального развития (обзор Kloosterman, Plasterk, 2006). МикроРНК необходимы для выключения материнских генов, дифференцировки разных клеточных типов, морфогенеза, регуляции уровня пролиферации клеток и апоптоза.

В развитии микроРНК выступают не только как посредники в молекулярных каскадах, но также могут запускать или ингибировать различные сигнальные пути. Например, miR-196 в развитии конечности позвоночных функционирует как регулятор экспрессии hoxb8, который, в свою очередь определяет эффект ретиноевой кислоты на экспрессию Shh и переднезаднюю полярность конечности Введение определенных микроРНК (например, (Kloosterman, Plasterk, 2006).

специфичных для мышечной ткани miR-1, miR-133) провоцирует начало клеточной дифференцировки по соответствующему пути (Li, Gregory, 2008). МикроРНК вовлечены в регуляцию эпителиально-мезенхимного перехода, опосредуя эффекты таких сигнальных путей, как Shh, Notch, TGF, FGF на экспрессию генов E- и N-кадгеринов (Katoh, Katoh, 2008). В ходе регенерации плавника Danio rerio микроРНК miR-133 служит негативным регулятором, ингибируя экспрессию генов, связанных с пролиферацией (например, mps1).

При нормальном течении регенерации имеет место истощение пула miR-133, обусловленное действием FGF. При экспериментальном введении эктопической miR-133 ход регенерации замедляется, а ингибирование эндогенной усиливает miR-133 пролиферацию клеток бластемы и способствует увеличению размеров регенерата (Yin et 2008). По данным анализа, при формировании бластемы в al., micro-array регенерирующем хвосте аксолотля понижается (по сравнению с интактной тканью) экспрессия 32 микроРНК и повышается экспрессия 46 микроРНК. Для miR-196, характеризующейся наиболее значительным (в 37,2 раза) и стабильным во всех пробах повышением экспрессии, были обнаружены непосредственные мишени – гены, определяющие дорсальные домены спинного мозга, BMP4, pax7 и msx1. Экспрессия всех вышеперечисленных генов в ранних регенератах хвоста значительно возрастала при введении ингибитора miR-196 (Sehm et al., 2009).

Модификации гистонов также играют существенную роль в регенерации и развитии. Существенными изменениями набора модификаций гистонов сопровождается, например, дедифференцировка клеток при регенерации хрусталика тритона (Maki et al., 2010). Паттерн метилирования гистонов, характерный для бластемных клеток при регенерации у D. rerio, сходен с таковым эмбриональных стволовых клеток. Мутации по гену деметилазы Kdm6b приводят к ингибированию регенерации, доказывая важность эпигенетических модификаций в регуляции процессов регенерации (Stewart et al., 2009).

8. Белки теплового шока как факторы, участвующие в процессах развития и регенерации Белки теплового шока (heat shock proteins, HSP) – несколько семейств широко распространенных, высоко консервативных белков, открытых в связи с их способностью синтезироваться в ответ на повышение температуры. Классической общей функцией этих белков считается защита клетки при действии целого ряда неблагоприятных факторов, помимо теплового шока: химических токсинов, солей тяжелых металлов, окислительного стресса (Heikkila et al., 1982; обзор Parsell, Lindquist, 1993). Регуляция экспрессии генов теплового шока сходна у всех эукариот и осуществляется в основном на уровне транскрипции при участии фактора теплового шока 1 (heat shock factor 1, HSF1) (обзоры Morimoto, 1998; Voellmy, 2004). Неактивные мономеры HSF1 при стрессе формируют гиперфосфорилированные тримеры, связываются с цис-последовательностью ДНК, называемой heat shock element, HSE. Все белки теплового шока относятся к трем основным семействам: малые (sHSPs), в т.ч. -кристалины (16–42 кДа), семейство HSP70 и семейство HSP90. sHSPs, кроме -crystallin, не консервативны; они связываются с несвернутым белком, иногда образуя при этом мультимеры, и поддерживают его в таком виде до свертывания при участии ATP-зависимых шаперонов. К функциям этих белков относят формирование термотолерантности, участие в дифференцировке клеток, снижение внутриклеточного уровня активных форм кислорода, ингибирование апоптоза (обзоры Arrigo, 1998; Van Montfort et al., 2002; Heikkila, 2004; 2010).

К семейству HSP70 относят цитозольный индуцируемый белок HSP70, конститутивный HSC70, митохондриальный HSP70, HSP110, иммуноглобулин-связывающий белок BiP и белок внутренней поверхности ЭПР. Все эти белки неспецифически связываются с другими белками АТФ-зависимым образом, препятствуя их денатурации или неправильному сворачиванию и способствуя укладке в правильную конфигурацию (обзоры Morimoto, 1998; Heikkila, 2010). Семейство HSP90 содержит большое количество белков (среди которых индуцируемые -изоформы и конститутивные -изоформы), формирующих димеры и взаимодействующие со своими специфическими субстратами в присутствии АТФ. Среди субстратов HSP90 – разнообразные участники клеточных сигнальных путей, рецепторы стероидных гормонов и глюкокортикоидов, белки Raf, а также собственный фактор транскрипции HSF1 (обзоры Pearl, Prodromou, 2000; Heikkila, 2010). Многие белки теплового шока конститутивно присутствуют в клетках в больших количествах. Тем не менее, характер экспрессии и его изменение в ответ на внешние воздействия различаются как в разных тканях организма, так и в одинаковых тканях у разных видов (Bienz, 1984;

Rutledge et al., 1987; Near et al., 1990; Yu et al., 1994; Ali et al., 1996b).

8.1 Белки теплового шока в развитии амфибий На многих моделях, в том числе на X. laevis и P. waltl, были подробно изучены экспрессия некоторых генов теплового шока и синтез соответствующих белков в ходе оогенеза и эмбрионального развития. Было показано, что экспрессия этих генов в эмбриональных тканях во многом отличается от таковой во взрослых. На определенных стадиях развития в отдельных клеточных популяциях имеет место накопление ряда белков теплового шока, не связанное со стрессовыми воздействиями. Это дало возможность предположить, что белки теплового шока могут играть регуляторную роль в развитии амфибий. В некоторых случаях были показаны их регуляторные функции.

У X. laevis в ооцитах конститутивно присутствуют мРНК и белок HSP70 (Bienz, 1984), а так же целый ряд других мРНК – Hsp110, Hsp90, bip, и Hsp47 (обзор Heikkila, 2010). HSP90 может способствовать транспорту 60S-субъединиц рибосомы в цитоплазму (Schlatter et al., 2002), или же активировать и фосфорилировать Mos, протоонкоген, в свою очередь активирующий каскад MAP-киназы в мейозе (Fisher et al., 2000). Белок HSP30 кратковременно экспрессируется в цементной железе X. laevis на стадии ранней и средней хвостовой почки, где, возможно, помогает сворачиваться белкам, участвующим в секреции, и препятствует тем самым преждевременному апоптозу (Heikkila, 2003).

Конститутивная экспрессия мРНК Hsp27 детектируется в основном в скелетных и сердечных мышцах и в голове, в т.ч. хрусталиковой плакоде, начиная со стадии гаструлы, и сохраняется после стадии хвостовой почки. Введение антисмысловых морфолиновых олигонуклеотидов приводит к порокам развития сердца (Brown et al., 2007). На ранних стадиях эмбриогенеза экспрессия Hsp70 не детектируется (Bienz, 1984; Krone, Heikkila, 1988), в то время как мРНК hsc70 детектируется во всех клетках гаструлы, и количество ее возрастает вместе с включением зиготического генома, оставаясь существенным вплоть до стадии хвостовой почки (Ali et al., 1996b). Конститутивная экспрессия мРНК Hsp90 детектируется на всех стадиях развития, и ее уровень также увеличивается с началом экспрессии собственных генов зародыша (Ali et al., 1996a). В течение всего эмбриогенеза X. laevis экспрессируются и другие гены теплового шока – BiP (в эктодерме гаструлы и нервной пластинке нейрулы, а также в конечностях при введении тиреоидного гормона, что говорит о потенциальной роли в метаморфозе); Hsp110 (в головном конце и нервной пластинке нейрулы, а также в сердце, хрусталике, мозге и хорде на стадии хвостовой почки); Hsp47 (в нервной трубке, скелетных элементах, дерме, мышцах, где необходим для сворачивания коллагена) (обзор Heikkila, 2010).

Белок HSP70, являющийся индуцируемым в других клетках P. waltl (например, в печени и фолликулярных клетках), присутствует в ооцитах и накапливается в ходе оогенеза в норме (Billoud et al.

, 1993; Angelier et al., 1996), при этом тепловой шок увеличивает количество белка HSP70 только в конце оогенеза и на стадии гаструлы (Prudhomme et al., 1997). Также в ооцитах P. waltl конститутивно присутствуют мРНК Hsp90 и соответствующий белок (Coumailleau et al., 1995). У P. waltl мРНК Hsp70 и белок HSP70, присутствующие в ооцитах, детектируются в эмбрионах на всех стадиях вплоть до поздней хвостовой почки. Во время дробления HSP70 присутствует во всех бластомерах, а локализация его демонстрирует причастность к событиям клеточного цикла: в основном она околоядерная, в профазе смещается в ядро в область эухроматина, в метафазе – к микротрубочкам веретена деления. Во время гаструляции HSP70 присутствует в перинуклеарной области части эндодермальных клеток и в большом количестве в колбовидных клетках, а также в ядрах ввернувшихся клеток. В ходе нейруляции он присутствует в перинуклеарной области эндо- и мезодермальных клеток, а также появляется в ядрах нейроэктодермальных клеток после сворачивания нервной трубки. На стадии хвостовой почки он присутствует в ядрах клеток эндодермы и сомитной мезодермы (Angelier et al., 1996). Было показано, что переход HSP70 в ядро связан с событиями клеточного цикла: в ядре HSP70 ассоциируется с эухроматином и обеспечивает транскрипцию на хромосомах типа ламповых щеток в начале S-фазы, предположительно, участвуя в переносе в ядро белков-регуляторов (Moreau et al., 1994;

1998; Corporeau et al., 2000). У Ambystoma mexicanum конститутивная экспрессия Hsp70 детектируется со стадии гаструлы, когда она сосредоточена на дорсальной стороне зародыша, и постепенно нарастает, распространяясь на голову, сомиты и конечности (Levesque et al., 2005).

8.2 Белки теплового шока в регенерации Роль белков теплового шока в регенерации все еще мало изучена, однако на самых разных моделях было показано, что они синтезируются в ответ на повреждение и присутствуют в больших количествах в клетках регенератов. В некоторых случаях было продемонстрировано, что белки теплового шока взаимодействуют с компонентами важных для регенерации и морфогенеза сигнальных путей и необходимы для нормального прохождения регенерации. На примере книдарий была показана связь между белками теплового шока и важнейшими сигнальными путями. Тепловой шок на стадии поздней гаструляции у гидры приводил к повышению экспрессии гена hsc71, а также вспышке экспрессии и последующему длительному ингибированию экспрессии компонентов сигнального пути Wnt; морфологическим результатом такого воздействия было нарушение разметки тела и формирования головного конца. Такой же эффект имела «over»-экспрессия hsc71 у трансгенных животных, а блокирование мРНК hsc71 методом РНК-интерференции нивелировало как молекулярные, так и морфологические последствия теплового шока (Duffy et al., 2012). У планарий белки теплового шока необходимы для поддержания пула необластов, являющихся клеточным источником физиологической и репаративной регенерации. Если в других клетках их синтез в основном запускается в ответ на стрессовое воздействие, то в необластах осуществляется конститутивно, и нокдаун по этим белкам приводит к угнетению роста и регенерации (обзор Isolani et al., 2012). На Danio rerio было показано, что Hsp70 не только первым индуцируется при повреждении зрительного нерва, но и необходим для успешной регенерации: введение ингибитора HSP inhibitor I замедляло рост аксонов и впоследствии приводило к нарушению оптомоторного поведения (Nagashima et al., 2011). При регенерации хвостового плавника D. rerio имеет место экспрессия Hsp60 в клетках бластемы. Мутация в этом гене приводит к митохондриальным дефектам и апоптозу бластемных клеток, нарушению роста бластемы и невозможности регенерации плавника, а также, что интересно, нарушает регенерацию сердца (Makino et al., 2005). При перерезке седалищного нерва Rana temporaria из клеток поврежденной области выделяется белок HSP70, который захватывается поврежденными чувствительными аксонами и ретроградно транспортируется в тела нейронов (Edbladh et al., 1994). С помощью трансгенных X. laevis, у которых после ампутации конечности блокируется сигнальный путь BMP и, соответственно, регенерация, было показано, что к числу генов, зависящих от BMP и необходимых для регенерации, относится и ген теплового шока Hsp60 (Pearl et al., 2008).

Травмирование при ампутации конечности у тритона N. viridescens приводит к синтезу белков теплового шока HSP90, HSP30, HSP70 и HSP68 в зоне повреждения в течение первых часов после ампутации (Carlone, Fraser, 1989; Tam et al., 1992). Ген Hsp70 экспрессируется и при регенерации конечности аксолотля Ambystoma mexicanum. Если в инактных тканях уровень экспрессии Hsp70 невысок, то уже через 24 часа после ампутации начинается его повышение, достигающее максимума во время дедифференцировки; позднее высокий уровень экспрессии сохраняется в бластемных клетках в дистальной части регенерата (Levesque et al., 2005). Таким образом, имеющиеся данные, полученные на разных моделях, говорят о перспективности изучения экспрессии белков теплового шока в регенерации в связи с предполагаемой их ролью в этом процессе.

9 Амфибии как модельный объект гравитационной биологии развития Роль факторов космического полета и гравитационной нагрузки в развитии амфибий интересовала исследователей еще с 1880-х годов (Pfluger, 1883 – цит. по Neff et al., 1986) в связи с очевидной ориентацией компонентов яйца вдоль гравитационного вектора. Первые эксперименты были направлены в основном на изучение механизмов перераспределения компонентов яйца и раннего морфогенеза, при этом гравитационная нагрузка была инструментом исследования. Очень скоро стало понятно, что амфибии являются превосходной моделью для изучения более широких вопросов, касающихся влияния факторов космического полета и гравитационной нагрузки на различные процессы развития. К настоящему времени на амфибиях проведены длительные серии экспериментов in vivo в области гравитационной биологии развития и накоплен большой массив данных, благодаря чему они занимают достойное место в ряду модельных объектов исследований в этом направлении. Среди других представителей этого ряда находятся бделлоидные коловратки (Ricci, Boschetti, 2003), Drosophila melanogaster и другие артроподы (обзор Marco et al., 1999), иглокожие (обзор Izumi-Kurotani, Kiyomoto, 2003), Danio rerio (Shimada et al., 2005), куриные эмбрионы (Suda et al., 1994), эмбрионы грызунов (обзор Tou et al., 2002; Crawford-Young, 2006).

9.1 Гравитационная биология развития Xenopus leavis Успешное оплодотворение X. laevis в условиях космического полета впервые было получено в эксперименте Уббельс (Ubbels, 1988). Дальнейшие эксперименты (Ubbels et al., 1994; Souza et al., 1995; De Mazire et al., 1996) подтвердили первые данные о том, что земная гравитационная нагрузка не является необходимой для формирования осей тела:



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |
 

Похожие работы:

«ШУБНИКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И ФОРМ АДАПТИВНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ К ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ 03.02.03 –...»

«МИГИНА ЕЛЕНА ИВАНОВНА ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ТРИЛАКТОСОРБ В МЯСНОМ ПЕРЕПЕЛОВОДСТВЕ 06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Кощаев Андрей...»

«Сафранкова Екатерина Алексеевна КОМПЛЕКСНАЯ ЛИХЕНОИНДИКАЦИЯ ОБЩЕГО СОСТОЯНИЯ АТМОСФЕРЫ УРБОЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.08 – экология (биологические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Сухарьков Андрей Юрьевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ОРАЛЬНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНАЦИИ ЖИВОТНЫХ 03.02.02 «Вирусология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, Метлин Артем Евгеньевич Владимир 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Характеристика возбудителя бешенства 2.2 Эпизоотологические...»

«Брит Владислав Иванович «Эффективность методов вакцинации против ньюкаслской болезни в промышленном птицеводстве» Специальность: 06.02.02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидат ветеринарных наук Научный руководитель:...»

«Мухаммед Тауфик Ахмед Каид ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОТИПОВ С ХОРОШИМ КАЧЕСТВОМ КЛЕЙКОВИНЫ, ОТОБРАННЫХ ИЗ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ МЯГКОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МАРКЕРОВ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«Будилова Елена Вениаминовна Эволюция жизненного цикла человека: анализ глобальных данных и моделирование 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант доктор биологических наук, профессор А.Т. Терехин Москва 2015 Посвящается моим родителям, детям и мужу с любовью. Содержание Введение.. 5 1. Теория эволюции жизненного цикла. 19...»

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 – эпидемиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии СССР профессор, доктор медицинских наук Ющенко Галина Васильевна Москва – 20 Содержание...»

«ПИМЕНОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА IN VITRO НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор...»

«Шинкаренко Андрей Семенович Формирование безопасного и здорового образа жизни школьников на современном этапе развития общества Специальность 13.00.01– общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научные...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Куяров Артём Александрович РОЛЬ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ И ЛИЗОЦИМА В ВЫБОРЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СТУДЕНЧЕСКОЙ МОЛОДЕЖИ СЕВЕРА 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«Ульянова Онега Владимировна МЕТОДОЛОГИЯ ПОВЫШЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ BRUCELLA ABORTUS 19 BA, FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ, YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант:...»

«ХАПУГИН Анатолий Александрович РОД ROSA L. В БАССЕЙНЕ РЕКИ МОКША 03.02.01 – ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Силаева Татьяна Борисовна д.б.н., профессор САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ РОДА ROSA L. В БАССЕЙНЕ МОКШИ. Глава 2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОДА ROSA L. 2.1. Характеристика рода Rosa L. 2.2. Систематика рода Rosa L. Глава 3....»

«Смешливая Наталья Владимировна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ СИГОВЫХ РЫБ ОБЬ-ИРТЫШСКОГО БАССЕЙНА 03.02.06 Ихтиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент Семенченко С.М. Тюмень – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«БРИТАНОВ Николай Григорьевич ГИГИЕНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕПРОФИЛИРОВАНИЯ ИЛИ ЛИКВИДАЦИИ ОБЪЕКТОВ ПО ХРАНЕНИЮ И УНИЧТОЖЕНИЮ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ 14.02.01 Гигиена Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор...»

«Моторыкина Татьяна Николаевна ЛАПЧАТКИ (РОД POTENTILLA L., ROSACEAE) ФЛОРЫ ПРИАМУРЬЯ И ПРИМОРЬЯ 03.02.01 – Ботаника Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Н.С. Пробатова Хабаровск Содержание Введение... Глава 1. Природные...»

«ДОРОНИН Игорь Владимирович Cистематика, филогения и распространение скальных ящериц надвидовых комплексов Darevskia (praticola), Darevskia (caucasica) и Darevskia (saxicola) 03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, заслуженный эколог РФ Б.С. Туниев Санкт-Петербург Оглавление Стр....»

«Карачевцев Захар Юрьевич ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ (АКАРИЦИДНЫХ) СВОЙСТВ РЯДА СУБТРОПИЧЕСКИХ И ТРОПИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ В ОТНОШЕНИИ ПАУТИННОГО КЛЕЩА TETRANYCHUS ATLANTICUS MСGREGOR Специальность: 06.01.07 – защита растений Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Попов Сергей...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.