WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


«РАЗРАБОТКА НОВОГО МЕТОДА КРУПНОМАСШТАБНОГО ПОИСКА ГИПОМЕТИЛИРОВАННЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ УЧАСТКОВ В ГЕНОМАХ ЭУКАРИОТ ...»

На правах рукописи

Баскаев Константин Константинович

РАЗРАБОТКА НОВОГО МЕТОДА КРУПНОМАСШТАБНОГО ПОИСКА

ГИПОМЕТИЛИРОВАННЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ УЧАСТКОВ В ГЕНОМАХ ЭУКАРИОТ

03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2015

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, в группе геномного анализа сигнальных систем клетки

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Буздин Антон Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Климов Евгений Александрович, в.н.с. Кафедры генетики Биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова кандидат биологических наук Серёгин Юрий Александрович, начальник отдела клеточной инженерии Департамента экспериментального производства ООО "Фармапарк"

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Защита состоится «9» декабря 2015 года в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук по адресу: 117997 ГСП-7, г. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.

Овчинникова Российской академии наук и на сайте http://www.ibch.ru

Автореферат разослан «__» _______ 2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук В. А. Олейников

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Эпигенетика — быстро развивающаяся область молекулярной биологии, пытающаяся ответить на вопрос «Как работает геном?». Тогда как каждая содержащая ядро клетка, за исключением лимфоцитов, человеческого организма несет один и тот же набор генов разные гены в разных клетках экспрессируются в разное время, что и является одной из причин разнообразия клеток и тканей человеческого организма. Помимо важной роли в нормальном развитии организма, эпигенетические изменения сопровождают (или являются причиной) таких патологических процессов как онкогенез или старение.

Важную роль в эпигенетических процессах играет метилирование геномной ДНК. До настоящего времени главным методом изучения статуса метилирования генома является секвенирование ДНК, подвергнувшейся реакции бисульфитной конверсии. В случае полногеномных исследований за бисульфитной конверсией может следовать использование техник секвенирования следующего поколения (англ. Next Generation Sequencing, NGS) или анализ реакционных смесей на микрочипах. Так же, для выделения метилированных последовательностей из смеси фрагментов геномной ДНК может быть использована аффинная хроматография. Наконец, широкое применение находят метилчувствительные эндонуклеазы рестрикции.

Актуальной представляется возможность быстро и дёшево получать информацию о большом количестве гипометилированных последовательностей в геномной ДНК и осуществлять эпигенетические исследования в случае, если требуется получить набор гипометилированных последовательностей, но при этом не требуется изучать статус метилирования всей геномной ДНК.

Кроме этого, при анализе больших массивов данных, получаемых стандартными методами, указанными выше, закономерно возникает вопрос об адекватной оценке вклада ложноположительных и ложноотрицательных результатов в итоговые библиотеки с помощью контрольного метода.

Идеальный контроль при этом должен соответствовать следующим критериям:

-содержать достаточный объем данных для полногеномного исследования

-покрывать большое количество разнообразных локусов на разных хромосомах и в разных областях каждой хромосомы

-быть достаточно дешевым, хорошо воспроизводимым и не требовать длительного времени на каждый эксперимент.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - разработка нового метода полногеномного поиска гипометилированных последовательностей, названного nMETR (англ. non-Methylated Tag Recovery). При разработке метода основной упор делался на универсальность и наибольшее разнообразие покрываемых локусов человеческого генома.

В рамках поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

получить с помощью nMETR пилотные клонотеки на основе геномной ДНК человека получить с помощью nMETR ампликоны, содержащие последовательности гипометилированных локусов генома осуществить биоинформатический анализ полученных последовательностей, а также картировать местоположение обнаруженных гипометилированные последовательности в человеческом геноме.

В процессе выполнения работы была поставлена задача по детальному изучению предсказанной последовательности c11orf72, проверки наличия её транскрипции в наборе различных тканей и метилирования вероятной регуляторной области.

Научная новизна и практическая значимость.

Метод, разработанный в рамках данной работы, позволяет быстро получать информацию о большом количестве гипометилированных последовательностей в геномной ДНК, но при этом не требуется детального изучения статуса метилирования всего генома:

для изучения регуляции мобильных элементов для поиска индивидуальных копий высокоактивных мобильных элементов, расположенных вблизи деметилированных или гипометилированных функционально значимых локусов, таких как промоторы генов или CpG-островки для определения различий в метилировании геномов клеток в норме и при различных патологиях.

nMETR может применяться для изучения статуса метилирования ДНК любого эукариотического организма, имеющего геномные повторы и CG-метилирование, служить для быстрого обнаружения эпигенетических маркеров одновременно для большого количества тканей и образцов, выступать в качестве контроля в широкомасштабных исследованиях статуса метилирования геномной ДНК.

В процессе разработки nMETR автором было показано, что предсказанная ранее открытая рамка считывания белка c11orf72 специфична для генома человека и отсутствует в ДНК других высших приматов. Впервые проведен системный анализ транскрипции данной ОРС в тканях яичка, сердца, мозга, легких, мочевого пузыря, раковых тканях яичка и мочевого пузыря. Выявление и структурно-функциональный анализ подобных «новых»

последовательностей генома человека представляется важной научной задачей.

Связь работы с научными программами. Работа финансировалась в рамках программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН, грантом Президента Российской Федерации (480.2010.4) и грантом РФФИ (10-04-00593-а).

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 85 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 222 наименования и двух приложений. Диссертация содержит 17 рисунков и 5 таблиц.

Публикации. По материалам работы опубликованы 4 статьи и 2 тезиса научных конференций.

–  –  –

Метилчувствительные эндонуклеазы рестрикции. Многие эндонуклеазы рестрикции расщепляют геномную ДНК в зависимости от статуса метилирования их специфического сайта связывания. При этом, некоторые из них, называемые метилзависимыми, расщепляют только метилированные последовательности, а другие, называемые метилчувствительными, только деметилированные. Метилчувствительные эндонуклеазы рестрикции могут быть использованы для «зондирования» деметилированных геномных областей, а последующее лигирование супрессионных адапторов делает возможной ПЦР-амплификацию деметилированных локусов в масштабе генома. Расщепление геномной ДНК эндонуклеазой рестрикции, сайт узнавания которой содержит более одного CG-динуклеотида с большой вероятностью будет происходить в регуляторных областях.

Повторяющиеся последовательности. Различные повторяющиеся и образованные от них последовательности составляют до 69% всей последовательности человеческой ДНК. Так, в человеческом геноме содержится 106 копий ретротротранспозона Alu, которые, кроме того, ассоциированы с CG-богатыми регионами, помимо этого их расположение относительно различных генов достаточно случайно, т.е. на каждые 3 т.п.о. гаплоидного генома приходится примерно одна копия данного мобильного элемента. Ретротранспозоны LINE-1 как полноразмерные активные, так и делетированные с 5’-конца, составляют около 17% человеческого генома (около полумиллиона копий), кроме этого именно на LINE-1, а среди всех L1 на семейство Ta1d приходится большая часть случаев транспозиции. Большая группа ДНКкопий ретроэлементов человеческого генома, а именно эндогенные ретровирусы и часть ретротранспозонов, составляющих примерно 8% человеческой ДНК, содержат длинные концевые повторы (LTR, Long Terminal Repeats). Данные структуры являются сложными по своему составу, находятся на обоих концах ДНК-копии мобильного элемента и несут множество регуляторных последовательностей. Кроме этого, вследствие гомологичной рекомбинации часть LTR присутствуют в геноме в виде одиночных копий. В геноме человека насчитывается около 2x103 копий LTR семейства эндогенных ретровирусов HERV-K.

Мобильные элементы могут использоваться как своего рода «зонды», относительно равномерно покрывающие человеческий геном и, вместе с метилчувствительными рестриктазами, ограничивать количество анализируемых последовательностей.

Принцип метода. Исходя из вышеуказанных соображений, была разработана схема метода, названного nMETR или non-MEthylated Tag Recovery.

Принцип метода (схема приведена на Рис.1.) состоит в следующем: геномная ДНК обрабатывается метилчувствительной рестриктазой (что позволяет фрагментировать геномную ДНК и отличить гипометилированные сайты рестрикции), затем к полученному рестрикту лигируются супрессионные адапторы. Адапторы супрессируют ПЦР-амплификацию в случае, если на последовательности, к которой они лигированы, не отжигается праймер, используемый для амплификации вместе с адапторным. Если последовательность, к которой лигированы адапторы, содержит в себе сайт отжига праймера, использованного для амплификации в паре с адапторным, то амплификация происходит в обычном порядке.

Полученная лигазная смесь амплифицируется с праймерами к последовательностям адаптора и геномного повтора.

В разработанном варианте метода, целевые продукты представляют собой набор последовательностей, находящихся между деметилированным сайтом узнавания эндонуклеазы и геномным повтором.

Рисунок 1. Принципиальная схема метода nMETR.

Геномная ДНК обозначена серой линией, геномный повтор – оранжевым прямоугольником, супрессионные адапторы – зелеными прямоугольниками, стрелками показаны олигонуклеотидные праймеры. Геномная ДНК обрабатывается метилчувствительной рестриктазой (1), к полученному рестрикту (2) лигируются супрессионные адапторы (3) и полученная смесь амплифицируется с праймерами к последовательностям адаптора и геномного повтора (4).

2. Выбор мобильных элементов для nMETR

Для подбора праймеров выбрали три консенсусных последовательности: из класса SINE семейства Alu (около 106 копий), из класса LINE семейства L1 (5x105 копий в человеческом геноме) и LTR из эндогенных ретровирусов HERV-K (около 2x103 последовательностей). С использованными в работе консенсусными последовательностями мобильных элементов можно ознакомиться в Приложении 2. к диссертационной работе.

3. Получение пилотных клонотек

На начальном этапе работы были получены пилотные клонотеки на основе ДНК, выделенной из человеческого мозга. Геномная ДНК расщеплялась рестриктазой BspFNI (сайт рестрикции CG^CG). Степень расщепления геномной ДНК эндонуклеазой проверялась с помощью электрофореза в 1% агарозном геле (см. Рис.2.).

Рисунок 2. Рестрикция геномной ДНК, выделенной из тканей мозга человека.

M - маркер молекулярных масс, 1 – геномная ДНК из тканей человеческого мозга, обработанная рестриктазой BspFNI, 2 – геномная ДНК, выделенная из тканей человеческого мозга (на дорожки 1 и 2 наносилось по 100 нг ДНК).

Смесь продуктов рестрикции очищалась фенолом и хлороформом, после чего производилась лигазная реакция с очищенной смесью и адаптором. Полученная лигазная смесь амплифицировалась с праймерами к различным мобильным элементам: длинным концевым повторам (LTR) эндогенных ретровирусов HERV-K, LINE-элементам семейства L1 или SINEэлементам семейства Alu в паре с праймерами к последовательности супрессионного адаптора.

Амплификаты анализировались методом электрофореза в 1,5% агарозном геле (Рис.3.).

Последовательности олигонуклеотидов, использованных в работе можно найти в Приложении 1 к диссертационной работе. Сайты отжига праймеров на консенсусных последовательностях повторов указаны в Приложении 2 к диссертационной работе.

Полученные смеси продуктов амплификации клонировали, лигазными смесями трансформировался штамм E.coli XL1-Blue. Клоны анализировались на наличие вставки с помощью стандартных праймеров M13, после чего секвенировались. Положение прочитанных последовательностей в человеческом геноме определяли с помощью геномного браузера Калифорнийского университета UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu). Всего было проанализировано 200 клонов, полученных с праймерами к повтору Alu, из которых только 8 (4%) обладали ожидаемой структурой (т.е. содержали на своих концах остаток рестрикционного сайта BspFNI и фрагмент мобильного элемента), 95 клонов, полученных аналогичным образом с праймерами к длинным концевым повторам (LTR) суперсемейства HERV-K (3 клона с ожидаемой последовательностью вставки) и 100 с праймерами к консенсусной последовательности семейства L1 (один клон с ожидаемой последовательностью вставки).

Поскольку частота встречаемости клонов, несущих вставку с ожидаемой последовательностью, была выше у Alu-элементов, было принято решение продолжать работу с праймерами к повтору Alu.

Рисунок 3. Электрофореграмма продуктов ПЦР, полученных с помощью праймеров к последовательности супрессионных адапторов и различным геномным повторам.

М – маркер молекулярных масс, 1 – праймеры к повторам семейства L1, 2 – праймеры к повторам Alu, 3 – праймеры к LTR HERV-K.

Анализ клонов, амплифицированных с праймерами адапторной последовательности и повторам Alu показал, что большинство нецелевых вставок представляют собой последовательности, заключенные между двумя Alu-повторами, располагающимися в ориентации «голова к хвосту» и имеющие размеры больше чем ~290 п.о. (Рис.5А.).

На первоначальном этапе работы данная проблема решалась с помощью электрофореза на 1,5% агарозном геле и последующим выделением фрагментов ниже 290 п.о. (Рис.4., дорожка 3, выделено пунктирной рамкой). Это позволило увеличить пропорцию целевых последовательностей до 26% (52 клона из 200 секвенированных). Для исключения потерь целевых последовательностей, имеющих тот же размер, что и побочные ПЦР-продукты Alu-Alu, схема амплификации была усовершенствована, что позволило исключить разделение на геле и последующее выделение.

Рисунок 4. Продукты амплификации с праймерами к повтору Alu и последовательности адаптора.

1, 2, 3 – 25, 20 и 15 раундов амплификации с праймерами к повтору Alu и последовательности адаптора, фракция продуктов, выделенная из геля обведена пунктирной рамкой, 4 – контрольная амплификация с праймерами только к супрессионному адаптору, 5 – контрольная амплификация с праймерами только к последовательности Alu.

Вначале производилась амплификация лигазной смеси с праймером к повтору Alu, Alu1for (см. Рис.5Б.), полученный амплификат обрабатывался дуплекс-специфичной нуклеазой (ДСН), расщепляющей только двуцепочечную ДНК, после чего производилась очистка продуктов реакции фенолом и хлороформом и осуществлялась дальнейшая амплификация с праймерами Alu1for и Na21 (к адапторной последовательности). Затем процедура повторялась с использованием праймеров Alu2for – к последовательности повтора и St19CG – к последовательности адаптора). Продукты амплификации анализировались на 1,5% агарозном геле против контрольных продуктов, полученных без добавления ДСН.

Рисунок 5. (А) Схема, иллюстрирующая применение nMETR c праймерами к повторам Alu.

При наличии двух рядом стоящих повторов в одном рестрикционном фрагменте с пришитыми адапторами (2, 3) возможна амплификация без участия праймеров к адапторной последовательности с образованием побочных продуктов (4). (Б). Включение в nMETR стадии амплификации с праймером только к последовательности повтора с последующей обработкой ДСН, расщепляющей двуцепочечную ДНК позволяет накопить одноцепочечные продукты амплификации, содержащие как последовательность адаптора, так и повтора.

Такая схема позволила сохранить выход целевых последовательностей на приблизительно том же уровне, что и при очистке от побочных продуктов путем электрофореза: из 30 случайно отобранных клонов, полученных с использованием ДСН, 9 (или 30%) содержали остаток сайта рестрикции на одном конце и фрагмент повтора на другом.

4. Применение nMETR для поиска гипометилированных последовательностей в

–  –  –

Метод nMETR (с использованием ДСН для уменьшения количества нежелательных продуктов) был применён для поиска гипометилированных последовательностей в ДНК, выделенной из опухоли мочевого пузыря. Вместо рестриктазы BspFNI использовалась метилчувствительная эндонуклеаза рестрикции BspACI, расщепляющая неметилированный непалиндромный тетрануклеотид 5’-C^CGC-3’/3’-GGC^G-5’ с образованием выступающих концов, поэтому полученная смесь вначале обрабатывалась фрагментом Клёнова, а только затем к полученным продуктам лигировались по тупым концам супрессионные адапторы Na21St19/StII, после чего производилась амплификация. Электрофореграмма полученных смесей продуктов ПЦР представлена на Рис.6.

Рисунок 6. Продукты, полученные методом nMETR из геномной ДНК опухоли мочевого пузыря с обработкой ДСН.

1 – 5 – ПЦР-смеси, полученные nMETR с обработкой ДСН с праймерами к последовательности супрессионного адаптора (St19-CG) и последовательности геномного повтора Alu (Alu2for), 10, 15, 20, 25 и 30 раундов амплификации соответственно; 6 – 10 – контрольные ПЦР-смеси, полученные без обработки ДСН, 10, 15, 20, 25 и 30 раундов амплификации соответственно.

Пилотная клонотека содержала 15 клонов. Как видно из Табл.1., 4 последовательности находились в области многочисленных повторов Alu, 3 - в окрестностях СpG – островка гена ATP6V1C1, а одна – в первом интроне гена NDUFV1.

Для проверки статуса метилирования использовалось т.н. «бисульфитное секвенирование», (Bisulfite Sequencing Assay, BSA), позволяющее напрямую устанавливать

–  –  –

Анализ последовательностей конвертированной ДНК осуществлялся с помощью программы BiQAnalyser. Программа сравнивает последовательности рекомбинантных вставок ДНК, конвертированной бисульфитом, и сравнивает их с исходной последовательностью анализируемого локуса. На основании сравнения строится схема, где каждая горизонтальная линия – это последовательность рекомбинантной вставки, а кружки на ней – отдельные CpG – динуклеотиды, при этом заливка черным цветом соответствует метилированному CpG, а отсутствие заливки – неметилированному.

При подготовке иллюстраций в целях наглядности и экономии места нарушен масштаб схем. Положение сайта рестрикции указывается с помощью рамки.

Согласно показанным на Рис.7. результатам степень деметилирования прилежащих последовательностей коррелирует с таковым для сайта рестрикции BspACI.

Рисунок 7. Результаты проверки данных, полученных с помощью nMETR методом «бисульфитного секвенирования» для последовательностей из двух геномных локусов: в локусе 8q22.

3 проанализирована окрестность сайта рестрикции BspACI в первом экзоне и интроне гена ATP6V1C1, в локусе 11q13.2 проанализирована окрестность сайта рестрикции BspACI в первом интроне гена NDUFV1. Изображение получено с помощью программы “BiqAnalyser” (с изменениями), каждая линия обозначает последовательность клона из библиотеки конвертированных последовательностей, кружки – отдельные CpG, наличие метильной группы у цитозина обозначается заливкой. Положение сайтов рестрикции BspACI (CCGC) указано с помощью прямоугольной рамки, масштаб не сохранён.

5. Крупномасштабное секвенирование nMETR-библиотек

Используя вышеописанный протокол nMETR c метилчувствительной эндонуклеазой BspFNI, геномным повтором Alu, был получен амплификат, который затем дважды очистили в 1,5% агарозном геле. Из очищенного амплификата был подготовлен образец для анализа на геномном анализаторе GS FLX Roche (454). Секвенирование осуществлялось центром «Биоинженерия» РАН.

Для анализа полученной информации сотрудником нашей лаборатории Андреем Викторовичем Гаража была разработана специализированная программа, “PostParser” (доступна онлайн http://www.postparser.net). Программа проверяла наличие в прочитанной последовательности фрагментов адапторного праймера и повтора Alu, после чего картировала её на человеческий геном с использованием геномного браузера Калифорнийского университета «The UCSC Genome Browser»). При этом отбирались последовательности, содержащие на конце часть сайта рестрикции BspFNI (CGCG) и осуществлялся подсчет последовательностей, приходящихся на каждый геномный локус для каждого CGCG. Помимо этого, вычислялось расстояние от сайта рестрикции BspFNI до известных генов, мест считывания РНК или CpGостровков. Детальное описание “PostParser” опубликовано в сети Интернет (http://www.postparser.net).

После секвенирования рассматривались фрагменты размером не менее 70 п.о. (32990 или ~48% из 68729 исследованных последовательностей). Из 32990 подходящих по размеру последовательностей программой были отобраны 6589 целевых последовательностей (~20% и ~10% всех прочтений вообще), содержащих остаток сайта рестрикции, 3’-концевой фрагмент геномного повтора Alu, и участок геномной ДНК между ними. Остальные продукты приходились на упомянутые выше последовательности Alu-Alu, продукты неспецифичного расщепления рестриктазы и продукты неправильного лигирования.

6589 целевых последовательностей несли информацию о 1113 уникальных локусах человеческого генома, при этом 711 (64%) локусов находились в окрестности (т.е. на расстоянии около 200 п.о.) CpG-островков. Полностью база данных, полученная на данном этапе работы доступна в сети Интернет (http://nMETR.pparser.net). В краткой форме данные сведены в Табл.2.

Последовательностей Количество, шт.

Всего: 68729 Целевых: 6589 Уникальных целевых: 1113 Уникальных в окрестностях CpG–островков: 711 Таблица 2. Некоторые характеристики базы данных, полученной на основе анализа результатов программой “PostParser” крупномасштабного секвенирования на приборе GS FLX Roche (454) центра «Биоинженерия» РАН.

Различные локусы генома были представлены в выборке фрагментов, полученных с помощью nMETR, в различном количестве (см. Рис.8.). Поэтому было решено проверить наличие корреляции между уровнем метилирования и количеством прочтений. Для оценки уровня метилирования использовался метод «бисульфитного секвенирования» Нами были проанализированы 9 геномных локусов, из которых

- 3 локуса с высоким числом прочтений (25 или больше)

- 3 со средним числом прочтений (5–8)

- 3 представлены в выборке одним прочтением Рисунок 8. Количество идентичных последовательностей в выборке из 6589 геномных локусов, найденных с помощью программы “PostParser”. По горизонтальной оси указано количество прочтений секвенатором продуктов nMETR. По вертикальной оси указано количество локусов, прочитанных указанное число раз.

При этом геномные локусы, представленные в выборке большим или средним числом прочтений оказались частично или полностью деметилированы, тогда как прочитанные только один раз оказались метилированы почти целиком. Также обнаружена высокая корреляция статуса метилирования сайта рестрикции (CGCG) и прилегающих последовательностей, проанализированных с помощью бисульфитного секвенирования (Рис.9.).

Рисунок 9. Результаты бисульфитного секвенирования 9 локусов, представленных различным в обработанных программой “PostParser” данных различным числом повторов.

Изображение получено с помощью программы “BiqAnalyser” (с изменениями), каждая линия обозначает последовательность клона из библиотеки конвертированных бисульфитом последовательностей ДНК, кружки – отдельные CpG, наличие метильной группы у цитозина обозначается заливкой. Красной рамкой обведены сайты рестрикции рестриктазы BspFNI (CGCG), масштаб не сохранён. Справа обозначен локус, на который была картирована найденная последовательность и количество прочтений.

6. Заключение

С помощью разработанного протокола nMETR получены 6589 нуклеотидных последовательностей, несущих информацию о статусе метилирования 1113 уникальных локусов человеческого генома, из которых 711 (64%) находились в окрестности CpG-островков. При этом показано, что последовательности, прочитанные один раз высокометилированы, а прочитанные больше пяти раз – гипометилированы, что позволяет сделать вывод о статусе метилирования nMETR последовательности в зависимости от количества её прочтений в итоговой библиотеке. Проверка результатов nMETR c помощью бисульфитного секвенирования подтверждают пригодность метода для количественного анализа уровня метилирования найденных локусов.

Протокол метода включает в себя стадию амплификации, которая может влиять на распределение фрагментов ДНК в выборке вследствие эффекта «ПЦР-сдвига» (англ. “PCR bias effect”). В этом случае возможно снижение негативных эффектов с помощью уменьшения числа раундов ПЦР или использования более процессивной полимеразы, так как количество ДНК, необходимое для «глубокого» секвенирования снижается в ходе усовершенствования приборов и методов NGS.

В ходе работы показано, что возможно совмещение nMETR с любым современным подходом NGS. Единственным ограничением в этом случае является необходимость секвенирования достаточно длинных фрагментов, покрывающих повторяющиеся последовательности.

7. Экспериментальный анализ специфичной для человека открытой рамки

–  –  –

При проверке статуса метилирования геномной ДНК для участка генома в локусе 11q13.2 (Рис.7.) был замечен предсказанный ген c11orf72, находящийся в обратной ориентации к NDUFV1 и имеющий с ним общий CpG-островок. Было принято решение исследовать данную ОРС и её регуляторную область более подробно.

Ген c11orf72 (также известен как FLJ90834) был предсказан ранее на основании анализа транскриптома и внесен в реестр генов человека. Выравнивание транслированной открытой рамки считывания (ОРС) гена c11orf72 человека против ортологичных последовательностей шимпанзе и макака резуса показывает, что человеческая ОРС содержит стоп кодон через 753 п.о. после точки начала трансляции, а в последовательностях шимпанзе и макака резуса стопкодоны появляются существенно раньше – после 32 кодона (Рис.10Б., отмечены красной стрелкой). Таким образом, из трех рассмотренных видов приматов, только человек содержит соответствующую этому локусу открытую рамку считывания.

Рисунок 10. (А) Схема окрестности гена c11orf72 и строения его второго (кодирующего) экзона. Обозначены ген домашнего хозяйства NDUFV1, его CpG-островок, представлена схема строения c11orf72. Второй экзон c11orf72 (вынесен), состоит из фрагментов последовательностей трех мобильных элементов. Обозначены сайты отжига праймеров 1 – для OT-ПЦР, 2 – к вероятной 5’-регуляторной области c11orf72 при «бисульфитном секвенировании», 3 - к CpG-островку NDUFV1 при «бисульфитном секвенировании».

(Б) Выравнивание транслированной последовательности ОРС гена c11orf72 человека и ортологичных последовательностей шимпанзе и макаки резус. ч – транслированная последовательность человека, ш – транслированная последовательность шимпанзе, р – транслированная последовательность макаки резус. Ранние стоп-кодоны, прерывающие рамки считывания у макаки-резус и шимпанзе отмечены красной стрелкой.

Уровень транскрипции c11orf72 в различных нормальных и подвергнувшихся злокачественному перерождению тканях человека (в семенниках, сердце, тканях мозга, легких, мочевом пузыре, раке яичка и раке мочевого пузыря) определяли при помощи ОТ-ПЦР (схему отжига праймеров см. на Рис.10А.). Эксперимент показал отсутствие транскрипции c11orf72 во всех исследованных тканях, на фоне высокой транскрипционной активности ACTB1 в качестве эндогенного контроля (Рис.11.).

Рисунок 11. Результаты ОТ-ПЦР скрининга транскрипционной активности гена c11orf72.

ОТ-ПЦР проводили с кДНК, полученной из различных тканей человека, с праймерами к гену актина и II экзону c11orf72. Количество раундов ПЦР указано слева. Ткани, для которых были получены образцы кДНК, указаны снизу. 1- электрофореграммы ПЦР-продуктов, полученных амплификацией соотв. кДНК с праймерами к гену –актина ACTB1. 2– электрофореграммы ПЦР-продуктов, полученных амплификацией соотв. кДНК с праймерами ко II экзону c11orf72, RT- реакционная смесь без добавления ревертазы, RT+ - с добавлением ревертазы. ДНК – положительный контроль с ДНК плаценты человека в качестве матрицы.

Точка начала транскрипции одной из изоформ мРНК c11orf72 отстоит от точки начала транскрипции гена домашнего хозяйства NDUFV1 всего на ~150 п.о. Между обоими генами расположен CpG-островок, который продолжается к началу гена NDUFV1 и включает его первый экзон (Рис.10А.). Перечисленные особенности позволяют предположить для обоих генов наличие общих регуляторных последовательностей. NDUFV1 относится к генам домашнего хозяйства, кодирует один из компонентов митохондриальной электрон-транспортной цепи и экспрессируется во всех тканях организма, а c11orf72, согласно полученным данным, если и транскрибируется, то лишь в ограниченном наборе тканей.

Рисунок 12. Результаты бисульфитного секвенирования участка в 5’-области перед геном c11orf72 и CpG-островка гена NDUFV1 с использованием матриц геномной ДНК тканей больших полушарий мозга и геномной ДНК ткани мочевого пузыря. Закрашенные круги – метилированные CpG – динуклеотиды, белые круги – деметилированные CpG. Изображение получено с помощью программы BiQAnalyser, масштаб не сохранен. Анализ проводился для геномной ДНК из тканей мозга (данные объединены верхней скобкой) и мочевого пузыря (данные объединены нижней скобкой).

Проверка статуса метилирования CpG-островка гена NDUFV1 и области ДНК выше точки начала транскрипции c11orf72 для образцов тканей мозга и мочевого пузыря человека показывает высокий уровень метилирования геномной ДНК для участка c11orf72 и крайне низкий уровень метилирования для CpG-островка NDUFV1. Отсутствие экспрессии c11orf72 в исследованных человеческих тканях может быть опосредовано метилированием данного регуляторного участка. (Рис.12.).

Для установления внутриклеточной локализации C11orf72 на основе плазмидных векторов pTurboGFP-C и pTurboGFP-N (Евроген, Россия) были получены конструкции, содержащие полноразмерную ОРС с11orf72 в составе ОРС флуоресцентного белка TurboGFP для экспрессии N- и C-гибридных белков. Указанными конструкциями трансфецировали клетки линий NTera2/D1 (эмбриональный рак яичка) и HepG2 (рак печени), после чего изучалась внутриклеточная локализация рекомбинантных белков через 24, 48 или 72 часа при помощи конфокального микроскопа. Гибридные белки равномерно окрашивали трансфецированные клетки обеих линий для обеих использованных конструкций. Это свидетельствует об отсутствии выраженной специфичности во внутриклеточной локализации C11orf72.

Для проверки возможной цитотоксичности C11orf72, с использованием проточной цитофлуориметрии сопоставлялось число апоптотических клеток, экспрессирующих флуоресцентный белок и не экспрессирующих таковой в образцах клеточной культуры NT2/D1.

В опыте образцы клеточной культуры трансфецировались векторами, кодирующими химерные белки C11orf72-TurboGFP-С или C11orf72-TurboGFP-N. В качестве контрольных использовались культуры, трансфецированные «пустыми» (т.е. кодирующими обычный GFP) векторами pTurboGFP-C или pTurboGFP-N, соответственно. Для идентификации апоптотических клеток использовался метод окрашивания аннексином V, связанным с FITC).

Культуры анализировались через 24, 48 и 72 часа после трансфекции.

Во всех случаях, доли апоптотических клеток среди экспрессирующих GFP или флуоресцентный химерный белок (GFP+) и клеток, не экспрессирующих GFP или химерного белка (GFP-), были сопоставимы как в опыте, так и в контроле (Табл.3.). Полученные данные свидетельствуют в пользу отсутствия какого-либо выраженного цитотоксического эффекта у белкового продукта, кодируемого c11orf72.

Время после Трансфекционный вектор Апопот. Апопот. Эффективность трансфекции клеток клеток трансфекции, GFP+, % GFP-, % %

–  –  –

1. Разработан новый метод крупномасштабного поиска гипометилированных регуляторных участков в геномах эукариот и получены пилотные клонотеки на основе геномной ДНК, выделенной из человеческого мозга. Разработанный протокол успешно масштабирован для анализа полученных смесей с помощью высокопроизводительного секвенирования.

2. Продемонстрирована возможность бионформатического анализа данных, полученных с помощью nMETR. Осуществлен анализ 68729 последовательностей, несущих информацию о ~1100 геномных локусах, из которых 64% располагались вблизи известных CpG-островков. Показано, что последовательности, прочитанные один раз высокометилированы, а прочитанные более пяти раз гипометилированы.

3. При проверке статуса метилирования геномной ДНК для участка генома в локусе 11q13.2 был обнаружен ранее предсказанный ген c11orf72. Показано, что эта последовательность является специфичной для генома человека, произведен системный анализ её транскрипции и статус метилирования вероятной регуляторной области.

–  –  –

1. Baskaev K., Garazha A., Gaifullin N., Suntsova M. V., Zabolotneva A. A., Buzdin A. A.

nMETR: technique for facile recovery of hypomethylation genomic tags. // Gene – 2012. – Т. 498 – № 1 – 75–80с.

2. Баскаев К. К., Буздин А. А. Эволюционно недавние группы генетических мобильных элементов в геноме человека // Вавиловский журнал генетики и селекции – 2011. – Т. 15 – № 2 – 313–322с.

3. Баскаев К. К., Буздин А. А. Эволюционно недавние вставки мобильных элементов и их вклад в структуру генома человека / К. К. Баскаев// Журнал Общей Биологии – 2012. – Т. 73 – № 1 – 3–20с.

4. Баскаев К. К., Холоденко Р. В., Малахова Г. В., Гайфуллин Н. М., Корзенева Е. В., Сунцова М. В., Буздин А. А. Экспериментальный анализ специфичной для человека открытой рамки считывания c11orf72 // Биоорганическая Химия – 2013. – Т. 39 – № 2 – 151–158с.

2. Тезисы научных конференций по теме диссертации

1. Баскаев К.К., Буздин А.А. Новый метод широкомасштабного поиска гипометилированных последовательностей генома // Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященную 75-летию со дня рождения академика Ю. А. Овчинникова. Москва, 2009.

2. Баскаев К.К., Буздин А.А. Новый метод широкомасштабного поиска гипометилированных последовательностей генома // Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины. Москва, 2010.



 

Похожие работы:

«Солнцев Роман Викторович Лесоводственная эффективность осушительной мелиорации в заболоченных сосняках и на их вырубках в условиях Среднего Урала (на примере стационара «Северный»). 06.03.02. – Лесоведение, лесоводство, лесоустройство и лесная таксация. АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Екатеринбург – 2014 Работа выполнена на кафедре лесной таксации и лесоустройства ФГБОУ ВПО «Уральский государственный лесотехнический...»

«НЕСТЕРОВ Александр Александрович УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИН ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Aвтореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Владимир – 2015 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)....»

«АНДРЕЕВА НАДЕЖДА МИХАЙЛОВНА МЕТОДИКА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДОРОЖНЫХ КАРТ ПРИ ЭЛЕКТРОННОМ ОБУЧЕНИИ СТУДЕНТОВ ИНФОРМАТИКЕ (на примере экономических и биологических направлений подготовки) 13.00.02 – Теория и методика обучения и воспитания (информатика, уровень профессионального образования) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Красноярск – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего...»

«ДОБРЕНЬКОВ ДМИТРИЙ СЕРГЕЕВИЧ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЦЕНОТИЧЕСКИХ ОТНОШЕНИЙ БАКТЕРИАЛЬНЫХ СООБЩЕСТВ ПОЛОСТИ РТА И МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИНЦИПОВ БИОКОРРЕКЦИИ 03.02.03 – Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения...»

«Авилова Анастасия Александровна Экологическая оценка годичной динамики тяжелых металлов в базовых компонентах лесных экосистем северной части Московского мегаполиса (на примере ЛОД РГАУ МСХА имени К. А. Тимирязева) Специальность 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2015 Работа выполнена на кафедре экологии ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный...»

«ВАНГЕЛИ СЕРГЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ СРАВНИТЕЛЬНАЯ УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУР КЛЕТОК, ХРОНИЧЕСКИ ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИРУСОМ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва – 201 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении научно-исследовательский институт...»

«Шигапов Иршат Сайдашович ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ И РАЗВИТИЯ МАЛЫХ ОЗЕР УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ (НА ПРИМЕРЕ ГОРОДА КАЗАНИ) 25.00.36 Геоэкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата географических наук Москва 2014 Работа выполнена в федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет» на кафедре природообустройства и водопользования Научный...»

«Якимова Татьяна Николаевна Эпидемиологический надзор за дифтерией в России в период регистрации единичных случаев заболевания 14.02.02 эпидемиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2015 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия...»

«Малышев Алексей Владиславович КОМПЛЕКСНАЯ СИСТЕМА ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННЫХ МЕРОПРИЯТИЙ ПО ПОВЫШЕНИЮ КЛИНИКОФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХИРУРГИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ ВИТРЕОРЕТИНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ 14.01.07 – глазные болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва 2015 Работа выполнена на кафедре офтальмологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Институт повышения...»

«Дандал Али Шебли ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Владимир-2015 Работа выполнена в ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ) Россельхознадзора и в ФГБАОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» Научный руководитель: Макаров Владимир...»

«Бирюкова Лидия Игоревна Диагностика, клинико-морфологическая характеристика и лечение накожного папилломатоза и дерматоза внутренней поверхности ушной раковины у лошадей 06.02.04 – ветеринарная хирургия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва 2015 Работа выполнена в ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии МВА имени К.И. Скрябина» Научный руководитель: Сотникова Лариса Федоровна, доктор...»

«НАУМОВ Юрий Анатольевич АНТРОПОГЕННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРИБРЕЖНО-ШЕЛЬФОВЫХ ГЕОСИСТЕМ ОКРАИННЫХ МОРЕЙ ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ 25.00.36 – Геоэкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора географических наук Томск 2008 Работа выполнена на кафедре экологии и природопользования Владивостокского государственного университета экономики и сервиса Научный консультант: доктор географических наук, профессор Кочуров Борис Иванович Официальные оппоненты: доктор...»

«АСКАРОВ АЙБУЛАТ ДАМИРОВИЧ ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ И ЗАЩИТНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК ДРЕВЕСНО-КУСТАРНИКОВЫХ НАСАЖДЕНИЙ В УСЛОВИЯХ Г. УФЫ ПРИ ДЕЙСТВИИ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ Специальности: 03.02.01. – Ботаника (биология), 03.02.08 – Экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оренбург – 2015 Диссертационная работа выполнена на кафедре экологии и природопользования ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный педагогический университет...»

«АНДОСОВА ЛАРИСА ДМИТРИЕВНА КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ АСПЕКТЫ В ОЦЕНКЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ШЕЙКИ МАТКИ ПРИ ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 14.03.10 – клиническая лабораторная диагностика Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Нижний Новгород – 2014 Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России Научный консультант: Конторщикова Клавдия Николаевна – доктор биологических наук, профессор Официальные оппоненты:...»

«Курбонов Косим Муродович СОВРЕМЕННЫЕ ЭПИЗООТОЛОГО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И НАДЗОР ЗА БРУЦЕЛЛЕЗОМ В РЕСПУБЛИКЕ ТАДЖИКИСТАН 14.02.02 – эпидемиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2015 Работа выполнена в Таджикском научно-исследовательском институте профилактической медицины Министерства здравоохранения и социальной защиты населения Республики Таджикистан Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор...»

«НЕСТЕРОВ Александр Александрович УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИН ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» Aвтореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Владимир – 2015 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)....»

«Бантыш Ольга Борисовна Биосинтез пептид-нуклеотидного антибиотика микроцина С и его гомологов Специальность 03.01.03 молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ Диссертация на соискание учной степени кандидата биологических наук Москва Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук. Научный руководитель: Северинов Константин Викторович, доктор биологических...»

«ГАЛИНИЧЕВ АНДРЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ ЦИКАДОВЫЕ (HEMIPTERA, CICADINA) УРАЛА: СОСТАВ ФАУНЫ, ЭКОЛОГИЯ И ХОРОЛОГИЯ 03.02.08 – экология (биологические науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Нижний Новгород Работа выполнена на кафедре зоологии федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского» Научный руководитель: доктор биологических...»

«ВАРЕНЦОВА Алиса Алексеевна АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ ГЕНОВ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 03.02.02 «Вирусология» Aвтореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владимир – 2014 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)...»

«Дандал Али Шебли ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Владимир-2015 Работа выполнена в ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ) Россельхознадзора и в ФГБАОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» Научный руководитель: Макаров Владимир...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.