WWW.KONF.X-PDF.RU
БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Авторефераты, диссертации, конференции
 


«РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ ...»

На правах рукописи

РАДУГИНА Елена Александровна

РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА

ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ

ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ

03.03.05 – Биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2015

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Исследования в области регенерации, начавшиеся еще в XVIII веке, вновь приобрели актуальность с появлением современных методов исследования. Хвостатые амфибии относятся к классическим модельным объектам в данной области в силу высочайших регенерационных способностей, а также простоты в разведении, содержании и манипуляциях. В последнее время они активно использовались и как объекты гравитационной биологии. Данное исследование предпринято в связи с обнаружением интересного явления – зависимости формообразования при регенерации хвоста тритона от уровня гравитационной нагрузки. Это явление – редкий пример морфогенетического эффекта внешних физических факторов во взрослом организме. Механизмы преобразования сигналов таких факторов в биологические изменения, которые определяют морфогенетический контроль, в настоящее время изучены недостаточно. Предложенная модель позволяет обнаружить не только внутриклеточные механизмы восприятия и реагирования на внешние факторы, но и механизмы, осуществляющиеся на уровне межклеточных и межтканевых взаимодействий.

Степень разработанности темы исследования. Междисциплинарный характер темы исследования и трудности, связанные с проведением экспериментов в области гравитационной биологии, обусловили малую ее разработанность. Наиболее последовательные и информативные работы, касающиеся регенерации различных тканей и органов у хвостатых амфибий в условиях космического полета, симулированных невесомости и перегрузок, были выполнены в лаборатории проблем регенерации ИБР РАН в сотрудничестве с несколькими российскими и зарубежными коллективами.

Одним из последних достижений в этой серии работ стало обнаружение морфогенетического эффекта, изучению которого посвящена данная работа.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования явилось изучение измененного морфогенеза регенерирующего хвоста под действием внешних факторов: уточнение природы воздействия, выявление клеточных процессов, за счет которых хвост приобретает иное, ассиметричное строение, а также поиск сигнальных путей и регуляторных молекул, опосредующих данные изменения.

В рамках данной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) Воспроизвести обнаруженный эффект в лабораторных условиях, провести анализ устойчивости и достоверности его проявления, обратимости, зависимости от темпа регенерации; описать динамику развития эффекта.

2) Уточнить предполагаемую гравитационную природу действующего фактора.

3) Провести полное морфологическое описание получаемых регенератов на разных стадиях, а также изучить клеточные процессы, протекающие в них:

пролиферацию и апоптоз.

4) Проверить роль одного из главных морфогенетических регуляторов регенерации хвоста – Shh – в развитии наблюдаемого эффекта.

5) Тестировать другое системное воздействие – тепловой шок – на способность к индукции подобных морфогенетических изменений при регенерации хвоста у тритонов.

6) Провести фармакологическое ингибирование белков теплового шока в ходе регенерации хвоста тритона в нормальных условиях и в условиях, вызывающих изменение формы регенерата.

7) Исследовать динамику экспрессии генов Hsp70, Hsp90 в ходе регенерации и локализацию в тканях соответствующих белков, как в нормальных условиях, так и в условиях содержания, вызывающих морфогенетический эффект.

Научная новизна работы. В работе предлагается совершенно новая модель для исследований на стыке биологии развития и гравитационной биологии. Влияние внешних воздействий на регенерацию тканей хвоста было описано впервые, кроме того, получены первые данные по выявлению молекулярных посредников развития эффекта. Впервые были проведены оценка пролиферации и апоптоза в тканях регенерата, ингибирование сигнального пути Shh, регенерация в присутствии теплового шока, оценка экспрессии генов Hsp70, Hsp90, иммунохимическое исследование белков HSP70, HSP90, ингибирование белков теплового шока. Результаты этих экспериментов являются новыми и для исследований регенерации в стандартных лабораторных условиях.

Теоретическая и практическая значимость работы. Предложенная в работе модель позволяет изучать эффекты гравитационной нагрузки без применения дорогостоящего труднодоступного оборудования, выявляя клеточные, межклеточные, межтканевые аспекты воздействия внешних факторов, а также учитывая системные физиологические изменения в организме. Результаты, полученные в данной работе, являются необходимой базой для дальнейшего использования преимуществ описанной модели в решении этих и других вопросов. Проведенные исследования имеют и практическую ценность, поскольку в настоящее время на разных животных моделях показано, что механические силы способны вызывать нарушения в развитии и регенерации скелетно-мышечной, сердечно-сосудистой, иммунной и других систем организма, в то время как глубокое понимание соответствующих механизмов необходимо для предотвращения или компенсации морфогенетических аномалий.

Апробация работы. Результаты были неоднократно доложены в форме устных (13) и стендовых (5) докладов на ряде российских и международных конференций: 1) Конференция молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва; 2010, 2011, 2012, 2013; доклад трижды занимал призовые места); 2) Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва; 2011, 2014, 2015; в 2014 году доклад был удостоен первого места в подсекции «Биология развития»); 3) Всероссийская конференция «Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии» (Москва; 2011, 2012, 2015); 4) Всероссийская научная конференция «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» с международным участием (Москва; 2014); 5) Международная космическая научная ассамблея COSPAR (Бремен, 2010; Майсор, 2012; Москва, 2014); 6) Международная конференция 5th EMBO Conference Series on The Molecular & Cellular Basis of Regeneration & Tissue Repair (Сан Фели де Гуиксол, 2014); 7) Международная конференция 24 th Annual meeting of the European Tissue Repair Society (Эдинбург, 2014); 8) Международная научная школа EMBO Practical Course on Multi-level Modelling of Morphogenesis (Норидж, 2015).

Личное участие автора. Личный вклад автора состоял в анализе обширной литературы, планировании и выполнении экспериментов, проведении статистической обработки и интерпретации полученных результатов, подготовке данных для публикаций и представлении результатов исследований на российских и международных конференциях соответствующей тематики. Основные результаты работы получены лично автором. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 148 страницах, содержит 37 рисунков, 5 таблиц и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 218 цитируемых источника.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК – 2, тезисов докладов и материалов конференций – 11, публикаций в периодических изданиях, индексируемых в базе данных WOS – 3.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были взрослые тритоны Pleurodeles waltl (Michahelles, 1830).

Содержание животных и операции. Тритонов содержали в аквариумах при комнатной температуре. Для ампутации дистальной трети хвоста и фиксации регенератов тритонов наркотизировали в растворе MS-222 (1:1000).

Для изучения морфогенетического действия гравитационной нагрузки часть животных («субстратную группу») с первого дня после операции (п/оп) содержали в отдельных контейнерах на влажной подложке. Для экспериментов по тепловому шоку нагревание воды проводили постепенно в течение 90 мин, рабочую температуру 32°C поддерживали 60 мин, после чего пассивно остужали воду до исходной температуры.

Морфометрическое изучение регенератов хвоста проводили на фотографиях, сделанных с помощью бинокуляра, оснащенного камерой;

изображения последовательных стадий регенерации совмещали и измеряли в программе Adobe® Photoshop® CS5, используя особенности пигментации в качестве реперных точек. Форму хвоста описывали в терминах смещения кончика регенерата по вертикали с помощью коэффициента угла загиба хвоста K, рассчитываемого по формуле: K = Ltan/H, где L – длина регенерата, tan – тангенс угла загиба хвоста, H – основание регенерата (рис. 1).

длина регенерата

–  –  –

Эксперименты по исследованию обратимости морфогенетического эффекта. Аквариальный контроль (5 особей) и субстратную группу (15 особей) содержали раздельно до появления статистически значимых различий значений K, после чего часть животных из субстратной группы переносили в аквариумы, продолжая наблюдения и фотографирование в течение 10 дней.

Морфологическое изучение регенератов хвоста. Формировали аквариальный контроль и субстратную группу (по 9 животных). Через 14, 28 и 49 дней п/оп хвоста регенераты фиксировали в растворе Буэна, получали серийные сагиттальные парафиновые срезы (5 мкм), окрашивали их гематоксилином Эрлиха и заключали под покровные стекла для анализа под световым микроскопом. Стадии регенерации определяли по Iten, Bryant (1976a).

Изучение пролиферативной активности клеток в регенератах хвоста. Формировали аквариальный контроль и субстратную группу (по 9 особей). Материал фиксировали в 4% растворе формальдегида на 0,01 М PBS (pH 7,4) через 24 часа, 7 дней и 14 дней п/оп. За 3 часа до фиксации внутрибрюшинно вводили водный раствор 5-бромо-2'-дезоксиуридина (Zymed Laboratories) из расчета 20 мкл/1 г веса. Включение БрдУ детектировали на серийных сагиттальных парафиновых срезах с помощью набора Zymed® BrdU Staining Kit под световым микроскопом. Для каждого регенерата на 10 срезах вычисляли соотношение количества меченых клеток на вентральной и дорсальной сторонах (V/D) эпидермиса и подлежащих тканей, что позволило оценить уровень «асимметрии» пролиферативной активности клеток без сравнения абсолютных величин. Также подсчитывали долю апикально расположенных меченых клеток от всех меченых клеток эпидермиса. Для оценки индекса мечения срезы тех же образов окрашивали Hoechst 33342 (1 мкл/мл) и подсчитывали количество ядер в изучаемых областях.

Изучение апоптоза в регенератах хвоста. Формировали аквариальный контроль и группу на субстрате (по 9 особей). Материал фиксировали через 24 часа, 7 дней и 14 дней п/оп в растворе 4% формальдегида на PBS и обрабатывали для получения серийных сагиттальных парафиновых срезов, которые окрашивали реактивами набора DeadEnd™ Fluorometric TUNEL System (Promega) в соответствии с рекомендациями производителя. Срезы анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа.

Ингибирование сигнального пути Shh. Использовали 6 групп животных:

1) отрицательный контроль (в аквариуме и на субстрате, по 2 особи); 2) контроль специфичности (в аквариуме и на субстрате, по 3 особи), получавший раствор томатидина (Calbiochem); 3) опытные группы (в аквариуме и на субстрате, по 5 особей), получавшие раствор циклопамина (Calbiochem).

Агенты, растворенные в 96% этаноле, вводили в среду до концентрации 0,6 мкМ (дважды в неделю по 180 мин с 21 до 49 дней п/оп), либо внутрибрюшинно по 12 нмоль на животное (каждые 48 ч с 31 до 49 дней п/оп).

Ингибирование белков теплового шока проводили веществом Heat Shock Protein Inhibitor I (Santa Cruz Biotechnology), также известным как KNK437. По итогам сравнения эффективности наружного, внутрибрюшинного, внутримышечного внесения ингибитора для работы было выбрано наружное нанесение агента, растворенного в оливковом масле, в дозе 5 мкг на животное.

Формировали 6 групп животных: 1) отрицательный контроль (в аквариуме и на субстрате, по 3 особи); 2) контроль специфичности (в аквариуме и на субстрате, по 3 особи), получавший оливковое масло без ингибитора; 3) опытные группы (в аквариуме и на субстрате, по 8 особей), получавшие раствор ингибитора.

Воздействие ингибитора осуществлялось с 21 до 47 дней п/оп 12 раз.

Изучение экспрессии генов Hsp70 и Hsp90 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили на тканях интактного хвоста до и после теплового шока (по 4 образца) и регенератах хвоста на разных стадиях в аквариальном контроле и группе на субстрате (по 3 образца через 2, 28 и 49 дней п/оп). Фенол-хлороформным методом выделяли тотальную РНК, чистоту и концентрацию которой измеряли спектрофотометрически. От примесей геномной ДНК образцы освобождали ДНКазой I. Обратную транскрипцию проводили с набором «Синтез первой цепи кДНК (рэндом)» (Силекс).

Качественную оценку экспрессии генов Hsp70 и Hsp90 проводили методом ОТПЦР с помощью набора «Амплификация ДНК с ColoredTaq полимеразой»

(Силекс) на амплификаторе Eppendorf Mastercycler 5532 (Eppendorf); в качестве внутреннего контроля были выбраны гены Ef1-, Gapdh и -Actin. Праймеры для ПЦР (см. табл. 1) были сконструированы с использованием международной базе данных GenBank и сервиса BLAST. ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в 1,5% агарозном геле с бромистым этидием в TAE буфере и оценивали интенсивность свечения полос на УФ-трансиллюминаторе.

Секвенирование продуктов ПЦР, полученных с использованием специфических праймеров к нуклеотидной последовательности Hsp70 и Hsp90, показало их соответствие исходным последовательностям в базе данных GenBank (Авдонин и др., 2013). Количественную оценку экспрессии генов Hsp70 и Hsp90 проводили методом ПЦР в реальном времени с помощью 2,5 реакционной смеси с референсным красителем ROX (Синтол) на амплификаторе Step One Plus™ (Applied Biosystems); в качестве внутреннего контроля был выбран ген Ef1-. Специфичность реакции увеличили добавлением линейных разрушаемых проб (табл. 1). Исходные данные по приросту флуоресценции репортера, нормализованной по флуоресценции ROX, обрабатывали по алгоритму DARTPCR (Peirson et al., 2003). Для каждого образца относительное количество РНК изучаемого гена, нормированное по количеству РНК Ef1-, выражали через среднее значение в интактном контроле.

Таблица 1. Характеристики и источники специфических праймеров и проб.

Последовательности олигонуклеотидов Длина Ген Ta Прямой праймер Обратный праймер Проба продукта (0,4 мкМ) (0,4 мкМ) (0,2 мкМ) 5'-FAM CGCCAGCAACAATC GGCACAGGGATTT GGAAATACCAGCTTC 104 н.о. 63°С Ef1AGCACCGCACCATCAAGAAC-3' AAACTCACC-3' BHQ1-3' 5'- 5'GGCTAAGGTCATC CGGTAGAGGCTGGA нет 155 н.о. 56°С Gapdh CACGACAAC-3' ATGATATTCTG-3' 5'- 5CACCACGGCTCAC AAGAGAATGGTTATG нет 81 н.о. 63°С

-Actin CTTCAG-3' GTGCTGTTG-3' 5'-FAM CTGCCTGTGAGCGA GGCAGTTCGGAG AAGCGTGCTCTGGTG 132 н.о. 63°С Hsp70 GCCAAGAGAACCGCTGAG-3' ATGG-3' BHQ1-3' 5'- 5'- 5'-FAMGGTTGAGAAGGTG TGCCTTCATAATCCTT CGCCTTGTCTCTTC 103 н.о. 63°С Hsp90 ACTGTTTCCA-3' TCCATGT-3' GCCCTGCT-BHQ1-3' Иммуногистохимическое определение экспрессии белков HSP70 и HSP90 в тканях регенерирующего хвоста проводили на тканях интактного хвоста до и после теплового шока (по 3 образца) и регенератах хвоста на разных стадиях в аквариальном контроле и группе на субстрате (по 3 образца через 2, 28 и 49 дней п/оп). Было проведено сравнение различных процедур фиксации и проводки и разработан оптимальный протокол. Материал фиксировали в растворе PAGA (56% этанола, 20% полиэтиленгликоля, 4% глицерина, 2,5% ледяной уксусной кислоты на PBS; +4°С, 16 часов), отмывали и проводили по растворам сахарозы, замораживали в среде Tissue-Tek® O.C.T.

Compound (Sakura Finetek Europe) и получали сагиттальные криосрезы (10 мкм). Реакцию пермеабилизации проводили с раствором 0,25% Triton X-100 и 0,1% Tween 20 на PBS (30 мин), неспецифическое связывание антител блокировали раствором 3% BSA и 0,1 % Tween 20 на PBS (30 мин). Инкубацию с первичными антителами (табл. 2) проводили в растворе 3% BSA и 0,1 % Tween 20 на PBS (90 мин, 37°С), с вторичными антителами – в PBS (90 мин, tкомн). После каждой процедуры срезы отмывали в PBS. Окрашенные срезы, заключенные под покровные стекла в смеси глицерина и PBS, анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа.

Статистическая обработка данных. Обработку всех численных данных проводили в редакторе Microsoft Office Excel 2007 и программе STATISTICA 8.0; выбор статистического критерия осуществляли отдельно для каждого эксперимента, принимая во внимание количество групп сравнения, количество значений в группах сравнения, их распределение и дисперсию.

Таблица 2. Использованные в работе антитела, их источник и рабочие разведения.

Название Фирма Вид - Тип Антиген Раб.

Конц., мкг/мл Anti-HSP70 Abcam, мышь моноклональные рекомбинантный белок 5 antibody (N27F3-4) Англия IgG человека HSP70 Anti-HSP90 Abcam, мышь моноклональные очищенный белок 5 antibody (S88) Англия IgG1 HSP90 Achlya ambisexualis Alexa Fluor® 488 Molecular коза IgG1 Fc-фрагмент тяжелых 2 Goat Anti-Mouse Probes, цепей IgG мыши IgG1 (1) Antibody США

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1 Морфометрические исследования регенератов хвоста

1.1 Воспроизведение эффекта измененного морфогенеза при содержании на субстрате. Загиб формирующихся регенератов хвоста в группе, содержавшейся в лаборатории на субстрате, был обнаружен в экспериментах Фотон М2 и М3 (Grigoryan et al., 2008). Для воспроизведения этого эффекта регенерация хвоста тритона в аквариуме и на субстрате (по 10 особей) прослеживалась в течение 49 дней п/оп. Начиная с 21-го дня, осевые структуры в регенератах из группы на субстрате формировались под углом к переднезадней оси хвоста. Угол загиба хвоста в группе на субстрате на всех стадиях был меньше, чем в аквариуме, в то время как длина регенерата отличалась лишь первые 14 дней. Коэффициент загиба хвоста К уменьшался в обеих группах между 7 и 28 днями п/оп, что соответствует стадии бластемы и начала дифференцировки. После 28 дней п/оп значение К в аквариальном контроле стабилизировалось, а в группе на субстрате продолжило уменьшаться и стало достоверно меньше аквариального к концу эксперимента (рис. 2).

Таким образом, полученные результаты доказали устойчивое проявление эффекта изменения формы регенерата в зависимости от условий содержания (предположительно, гравитационной нагрузки).

–  –  –

1.2 Изучение темпов регенерации. Достижение последовательных стадий регенерации в аквариальном контроле в пяти проведенных экспериментах шло медленнее, чем описано в литературе. Во второй половине зимы, весной и летом темпы регенерации были сходны (0,126–0,133 стадия/день), в то время как поздней осенью темпы регенерации были ниже (0,081 и 0,100 стадия/день), что, видимо, отражает тормозящее влияние пониженных температур. При сравнении темпов регенерации в четырех экспериментах, включавших как аквариальный контроль, так и субстратную группу, достоверных различий между группами выявлено не было. Можно заключить, что сам факт содержания животных на субстрате не влияет на скорость регенерации.

1.3 Проверка обратимости изменения формы регенерата при содержании на субстрате дополнительно подтвердила описанную выше динамику изменения К в аквариуме и на субстрате. Через 32 дня п/оп различия между группами были признаны статистически достоверными, и 8 тритонов из группы на субстрате были перемещены в отдельный аквариум. В течение дальнейших 10 дней значение К в группе на субстрате продолжило снижаться, в то время как в группе, перенесенной в аквариум, несколько увеличилось. В результате этого данная группа стала отличаться от группы на субстрате и перестала достоверно отличаться от аквариального контроля. Можно заключить, что эффект изменения формы регенерата при содержании на субстрате, проявившись и достигнув уровня статистической достоверности, может быть обращен сменой условий.

2 Проявление эффекта загиба хвоста при регенерации с перегрузкой 2g Гипотеза о ведущей роли гравитационной нагрузки в изменении морфогенеза на субстрате была проверена в Эймском центре НАСА на трех группах животных: аквариальном контроле (5 особей), субстратной группе (12 особей) и в группе, подвергавшейся центрифугированию с перегрузкой 2g (12 особей). На рисунке 3 видно, что в субстратной группе, как и в группе центрифугирования, к 21 дню п/оп формируются загнутые регенераты, неотличимые друг от друга, но значимо отличающиеся от регенератов в аквариальном контроле. Результаты подтвердили наше предположение о гравитационной природе действующего фактора.

–  –  –

Заключение.

Целью данной работы было изучение не описанного ранее явления – изменения морфогенеза регенерирующего хвоста тритона в зависимости от внешних факторов. Были разработаны условия, в которых такое изменение устойчиво воспроизводится, и способы его измерения. Выяснилось, что содержание на субстрате приводит к загибу регенерата хвоста, предположительно, за счет увеличенной гравитационной нагрузки, в пользу чего свидетельствуют и результаты длительного центрифугирования. Было показано, что при смене условий приобретенное изменение формы оказывается обратимым. Это косвенно свидетельствует о том, что эффект внешнего воздействия на морфогенез регенерирующего хвоста опосредуется не основными морфогенетическими механизмами, а локальными механизмами контроля клеточного поведения. Изменение формы регенерата было описано на уровне морфометрии, морфологии и поведения клеток – пролиферации и апоптоза; в том числе было показано усиление пролиферации и утолщение в апикальном эпидермисе измененных регенератов. Отсутствие эффекта ингибирования важнейшего морфогена Shh на форму хвоста в аквариуме и на субстрате может говорить о том, что действие гравитационной нагрузки на морфогенез опосредуется нижележащими подчиненными механизмами регуляции клеточного поведения, например, пролиферации, апоптоза и миграции, что согласуется с другими нашими данными. Впервые было показано, что загиб регенерирующего хвоста может вызываться не только увеличением гравитационной нагрузки, но и периодическим действием теплового шока. Это говорит о существовании универсального механизма распознавания внешних воздействий различной природы и ответа на них. В качестве кандидатов на роль молекулярных посредников в таких механизме были предложены белки теплового шока. Действительно, их фармакологическое ингибирование препятствует развитию загиба хвоста на субстрате. Впервые была предпринята попытка охарактеризовать экспрессию генов теплового шока и локализацию соответствующих белков в ходе нормальной регенерации хвоста P. waltl и оценить ее изменение при действии повышенной гравитационной нагрузки. Было показано, что в регенератах из субстратной группы и в хвостах после теплового шока белки HSP70, HSP90 присутствует в нехарактерной для нормальных условий эпидермальной локализации. По итогам работы можно предположить, эпидермальные клетки являются «первичными сенсорами» внешних воздействий и проводниками информации о них. Изменения в эпидермальных клетках могут определять более поздние изменения в бластеме при формировании осевых структур регенерата посредством тканевых взаимодействий, имеющих место в регенерации. Существенная роль в рецепции и трансформации сигнала о воздействии в эпидермисе, вероятно, принадлежит белкам теплового шока.

ВЫВОДЫ

1) Впервые разработана модель, воспроизводящая изменения формы регенерирующего органа под действием внешних факторов. Обнаружено, что гравитационная нагрузка (1g) способна менять форму регенерата хвоста у тритона P. waltl.

2) С помощью методов компьютерной морфометрии и статистического анализа показано, что морфогенетический результат воздействий достоверен, не сопряжен с угнетением или ускорением регенерации и является обратимым при изменении условий содержания животных.

3) Показано, что на тканевом и клеточном уровнях изменения морфогенеза хвоста обусловлены особенностями строения эпидермиса, эпендимной трубки, хрящевого тяжа и бластемы регенератов. Впервые изучены пролиферация и апоптоз при регенерации хвоста тритона; показано локальное увеличение пролиферативной активности на фоне ограниченной гибели клеток эпидермиса регенератов у животных в условиях 1g в сравнении с аквариальным контролем.

4) Впервые проведен функциональный анализ роли сигнального пути Shh в регенерации хвоста тритона с помощью введения ингибитора – циклопамина. Воздействие ингибитора после формирования бластемы не приводило к нарушению регенерации и не влияло на развитие морфогенетического эффекта в условиях 1g.

5) Впервые обнаружено, что воздействие теплового шока в ходе регенерации вызывает изменения формы хвоста, сходные с таковыми на субстрате. Введение ингибитора белков теплового шока KMK437 при физиологически оптимальной температуре препятствует изменению формы хвоста в условиях 1g, но не влияет на форму регенерата в условиях аквариума.

6) Впервые на модели регенерации хвоста тритона исследована экспрессия генов Hsp70, Hsp90 и локализация их белков. Показано присутствие мРНК и белков в интактных тканях и на всех стадиях регенерации. Обнаружено повышение количества мРНК Hsp70 в начале регенерации; отмечена специфическая эпидермальная локализация белков HSP70, HSP90 исключительно в регенератах из групп воздействия перегрузкой и тепловым шоком.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 11-04-00125-а с использованием оборудования Центра коллективного пользования ИБР РАН.

Список сокращений ПЦР – полимеразная цепная реакция БрдУ – 5-бромо-2'-дезоксиуридин п/оп – после операции Статьи в журналах, соответствующих Перечню ВАК

1) Радугина Е.А., Григорян Э.Н. Морфогенетические изменения при регенерации хвоста у тритонов в условиях различной гравитационной нагрузки // Известия РАН. Серия биологическая. 2012. № 5. С. 478–485.

2) Григорян Э.Н., Маркитантова Ю.В., Авдонин П.П., Радугина Е.А.

Исследование регенерации у амфибий в эпоху молекулярно-генетических подходов и методов // Генетика. 2013. Т. 49. № 1. С. 55–72.

Благодарности Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н. Григорян Э.Н., к.б.н.

Маркитантовой Ю.В., к.б.н. Авдонину П.П., к.б.н. Поплинской В.А., к.б.н.

Новиковой Ю.П., д.б.н. Микаэляну А.С., д.б.н. Авдонину П.В., к.б.н. Маршак Т.Л., д.б.н. Васецкому С.Г., Dr. E. Almeida, Dr. N. Dvorochkin.



 

Похожие работы:

«Цвиркун Ольга Валентиновна ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС КОРИ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ. 14.02.02 эпидемиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва – 2014 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки « Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора Научный консультант: Заслуженный деятель науки РФ, профессор, доктор медицинских наук Ющенко...»

«СТОЛПОВСКАЯ Елена Владимировна СИНТЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПЛЕКСНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА – ПРОДУКТА ГЛУБОКОЙ ПЕРЕРАБОТКИ ДРЕВЕСИНЫ ЛИСТВЕННИЦЫ 05.21.03 технология и оборудование химической переработки биомассы дерева; химия древесины АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Иркутск Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского Сибирского...»

«ГАЛИНИЧЕВ АНДРЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ ЦИКАДОВЫЕ (HEMIPTERA, CICADINA) УРАЛА: СОСТАВ ФАУНЫ, ЭКОЛОГИЯ И ХОРОЛОГИЯ 03.02.08 – экология (биологические науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Нижний Новгород Работа выполнена на кафедре зоологии федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского» Научный руководитель: доктор биологических...»

«Степина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ФЛОРИСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЮГО-ЗАПАДНЫХ РАЙОНОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология (биологические науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2015 Работа выполнена в Балашовском институте (филиале) федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г....»

«Фомина Светлана Григорьевна ПЕЙЗАЖ ЭНТЕРОВИРУСОВ У ДЕТЕЙ С ОСТРОЙ КИШЕЧНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ 03.02.02. – вирусология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора. Новикова Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Надежда Алексеевна...»

«Бирюкова Лидия Игоревна Диагностика, клинико-морфологическая характеристика и лечение накожного папилломатоза и дерматоза внутренней поверхности ушной раковины у лошадей 06.02.04 – ветеринарная хирургия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва 2015 Работа выполнена в ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии МВА имени К.И. Скрябина» Научный руководитель: Сотникова Лариса Федоровна, доктор...»

«Потапова Анна Викторовна ВЛИЯНИЕ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ТРОФИЧЕСКИХ СУБСТРАТОВ ТЯЖЁЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ И ХЛОРОРГАНИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ НА КАЧЕСТВО ЛОСИНОГО МОЛОКА 03.02.08 – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2015 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Костромской государственный университет им. Н. А. Некрасова» Научный руководитель: доктор биологических наук, Баранов Александр Васильевич Официальные оппоненты: Марзанов Нурбий...»

«Нгуен Тхи Тху Ха МЕДОНОСНЫЕ РЕСУРСЫ ЛЕСНОГО ФОНДА ЛЕНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ И ЦЕНТРАЛЬНОГО ВЬЕТНАМА 06.03.02 Лесоведение, лесоводство, лесоустройство и лесная таксация АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2015 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Использование недревесных ресурсов вносит существенный вклад в улучшение качества жизни населения многих стран, включая Россию и Вьетнам. До настоящего...»

«ВАНГЕЛИ СЕРГЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ СРАВНИТЕЛЬНАЯ УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУР КЛЕТОК, ХРОНИЧЕСКИ ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИРУСОМ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва – 201 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении научно-исследовательский институт...»

«Гривенная Елена Николаевна МОНИТОРИНГ КАЧЕСТВА ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ В СИСТЕМЕ МВД РОССИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕЙТИНГОВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ 13.00.08 – Теория и методика профессионального образования Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора педагогических наук Краснодар – 2015 Работа выполнена в ФГКОУ ВПО «Краснодарский университет Министерства внутренних дел Российской Федерации». Научный доктор педагогических наук, профессор консультант: Ганченко...»

«Подсвирова Ирина Александровна Микробиологический мониторинг патогенов гнойновоспалительных заболеваний в хирургических отделениях и отделении реанимации и интенсивной терапии в многопрофильном стационаре 03.02.03 – микробиология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Москва — 2014 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Ставропольский государственный медицинский университет Минздрава Российской Федерации Научные руководители: Миронов Андрей...»

«Герасимов Максим Александрович Аэрозольная санация воздушной среды кролиководческих помещений при профилактике респираторных заболеваний кроликов 06.02.05ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарносанитарная экспертиза АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2015 Работа выполнена ФГБОУ ВПО «Московская государственная сельскохозяйственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина» на кафедре...»

«БЕРЕЗИНА Елена Сергеевна ПОПУЛЯЦИОННАЯ СТРУКТУРА, ОСОБЕННОСТИ МОРФОЛОГИИ И ПОВЕДЕНИЯ И РОЛЬ ДОМАШНИХ СОБАК И КОШЕК В РАСПРОСТРАНЕНИИ ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫХ ИНФЕКЦИЙ В РОССИИ 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Омск – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омский государственный педагогический университет» и ФБУН «Омский НИИ...»

«ДОМНИНА Виктория Леонидовна ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ Г. ТУЛА МЕТОДАМИ БИОИНДИКАЦИИ И БИОТЕСТИРОВАНИЯ 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тула 2015 Работа выполнена на кафедре биологии и экологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тульский государственный педагогический университет имени Л.Н....»

«СЕЛИФОНОВА Жанна Павловна СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЭКОСИСТЕМ ЗАЛИВОВ И БУХТ ЧЕРНОГО И АЗОВСКОГО МОРЕЙ (РОССИЙСКИЙ СЕКТОР) Специальность 25.00.28 – Океанология Д 002.140.01 Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Мурманск, 2015 Работа выполнена в ФГБУН Мурманском морском биологическом институте КНЦ РАН и ФГБОУ...»

«Мечов Максим Павлович КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РЕПАРАТИВНОГО ОСТЕОГЕНЕЗА ПРИ ИМПЛАНТАЦИИ ФИКСАТОРОВ С ПОКРЫТИЕМ НА ОСНОВЕ МЕТАЛЛОВ IV ГРУППЫ 06.02.04 – ветеринарная хирургия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва – 2015 Работа выполнена на кафедре ветеринарной хирургии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана» Научный руководитель Шакирова Фаина Владимировна доктор...»

«УШАКОВ АЛЕКСЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СОЧЕТАННОСТИ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ БИОГЕЛЬМИНТОЗОВ Специальность: 03.02.11 – Паразитология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Тюмень-2015 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Тюменский научно-исследовательский институт краевой инфекционной патологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научный консультант: Степанова...»

«Худоногова Елена Геннадьевна БИОЛОГИЯ, ЭКОЛОГИЯ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ПОЛЕЗНЫХ РАСТЕНИЙ ПРЕДБАЙКАЛЬЯ: АНАЛИЗ, ПРОГНОЗИРОВАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Специальность 03.02.01 – ботаника (биологические науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оренбург 2015 Работа выполнена на кафедре ботаники, плодоводства и ландшафтной архитектуры в ФГБОУ ВО «Иркутский государственный аграрный университет имени А.А. Ежевского» Научный консультант:...»

«Герасимов Максим Александрович Аэрозольная санация воздушной среды кролиководческих помещений при профилактике респираторных заболеваний кроликов 06.02.05ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарносанитарная экспертиза АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2015 Работа выполнена ФГБОУ ВПО «Московская государственная сельскохозяйственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина» на кафедре...»

«Дандал Али Шебли ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР 06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Владимир-2015 Работа выполнена в ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ) Россельхознадзора и в ФГБАОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» Научный руководитель: Макаров Владимир...»







 
2016 www.konf.x-pdf.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, диссертации, конференции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.